高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定馬鞭草中5種糖苷類成分的含量

王 華，任 非，段坤峰，陳學(xué)軍，袁志芳

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，河北 石家莊 050051；2. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000；3. 河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北 石家莊 050017)

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定馬鞭草中5種糖苷類成分的含量

王 華1，任 非2，段坤峰1，陳學(xué)軍1，袁志芳3

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院，河北 石家莊 050051；2. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000；3. 河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北 石家莊 050017)

目的 建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法同時(shí)測(cè)定馬鞭草中桃葉珊瑚苷、戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、龍膽苦苷、毛蕊花糖苷的含量。方法 色譜柱采用Waters SunfireTMC18(4.6 mm×150 mm,5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水(25∶75→40∶60)，梯度洗脫，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，柱溫30 ℃；采用電噴霧離子源(ESI)，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式(MRM)進(jìn)行定量分析。桃葉珊瑚苷、戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、龍膽苦苷在正離子電離模式下定量分析離子對(duì)分別為m/z 167.2→m/z 149.1、m/z 243.2→m/z 225.2、m/z 227.2→m/z 195.2、m/z 195.2→m/z 177.2。毛蕊花糖苷在負(fù)離子電離模式下定量分析離子對(duì)為m/z 461.3→m/z 161.0。結(jié)果 桃葉珊瑚苷、戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、龍膽苦苷、毛蕊花糖苷五種組分在120～1 200,10 000～100 000,5 000～50 000,1.2～12,510～5 100 μg/L的濃度范圍內(nèi)與峰面積均呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為101.2%，98.63%，99.45%，101.6%，100.3%。結(jié)論 本法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、具有良好的重現(xiàn)性, 為馬鞭草藥材的合理應(yīng)用及質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；桃葉珊瑚苷；戟葉馬鞭草苷；馬鞭草苷；龍膽苦苷；毛蕊花糖苷；馬鞭草

馬鞭草為馬鞭草科植物馬鞭草的干燥地上部分，收載于中國(guó)藥典2010版一部。具有活血散瘀、截瘧、解毒、利水消腫等功效[1]。藥典收載的馬鞭草是利用其脂溶性成分熊果酸作為鑒別和含量測(cè)定指標(biāo)的，而馬鞭草基本上采用水提和醇提工藝。因此，研究馬鞭草極性成分能夠更好地監(jiān)控藥材的質(zhì)量。另外，中藥材的定量方法多是該藥材中具有一定藥理活性的有效成分，本實(shí)驗(yàn)小組先前對(duì)馬鞭草不同提取物的鎮(zhèn)咳、抗炎和祛痰作用進(jìn)行了系統(tǒng)的藥效學(xué)研究[2]，結(jié)果表明馬鞭草醇提物的正丁醇部分和醋酸乙酯部分為鎮(zhèn)咳作用的有效部位，此后又對(duì)這兩部分的化學(xué)成分進(jìn)行了研究[3]，發(fā)現(xiàn)桃葉珊瑚苷、戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、龍膽苦苷、毛蕊花糖苷含量最高，是馬鞭草的主要活性成分，適合作為馬鞭草藥材的指標(biāo)性成分。因此，同時(shí)檢測(cè)馬鞭草中這5個(gè)糖苷類極性成分的含量對(duì)于馬鞭草藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究和質(zhì)量控制都具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)小組采用HPLC-MS/MS法測(cè)定取得了滿意的結(jié)果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材 料

1.1儀器 Applied Biosystems 3200 QTRAP高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，配有三重四級(jí)桿帶線性離子阱和電噴霧離子源ESI，analyst 1.4.2 software工作站)；Agilent1200型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司，包含G1322A型脫氣機(jī)，G1311A型四元泵，G1329A型自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A型柱溫箱，G1314B型紫外檢測(cè)器)。

1.2試藥 桃葉珊瑚苷、毛蕊花糖苷、龍膽苦苷對(duì)照品(批號(hào)分別為111761-200601，111530-200706，110770-200611)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；馬鞭草苷、戟葉馬鞭草苷為自制產(chǎn)品(經(jīng)柱色譜分離，且經(jīng)IR、MS、1H-NMR、13C-NMR確定結(jié)構(gòu)[4-5]，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98.5%。)；馬鞭草藥材購(gòu)自石家莊樂(lè)仁堂藥店及不同產(chǎn)地的藥業(yè)公司，經(jīng)河北藥科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室聶鳳褆教授鑒定。馬鞭草藥材經(jīng)40 ℃干燥后，粉碎過(guò)24目篩，備用。甲醇、甲酸均為色譜純(美國(guó)迪馬公司)，水為注射用水，其余試劑均為分析純?cè)噭?/p>

2 方 法

2.1溶液的制備

2.1.1供試品溶液 取藥材粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞100 mL錐形瓶中，加入20 mL 80%甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理45 min，放冷，稱質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)充減失的質(zhì)量，搖勻，微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液備用，即得。

2.1.2對(duì)照品溶液 分別精密稱取5種糖苷類化合物對(duì)照品適量，加80%甲醇溶解并稀釋制成含桃葉珊瑚苷1.2 mg/L、戟葉馬鞭草苷100.0 mg/L、馬鞭草苷50.0 mg/L、龍膽苦苷12 μg/L、毛蕊花糖苷5.1 mg/L的混合溶液，即得。

2.2色譜與質(zhì)譜條件

2.2.1色譜條件 色譜柱： Waters SunfireTMC18(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸水(25∶75→40∶60,0→6 min)，梯度洗脫；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；柱溫30 ℃。

2.2.2質(zhì)譜條件 采用正負(fù)離子電噴霧離子源(ESI)，選取靈敏度好的離子模式。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式(MRM)進(jìn)行質(zhì)譜掃描定量分析。通過(guò)離子去簇電位(DP)、入口電位(EP)和碰撞能量電位(CE)的優(yōu)化，選取響應(yīng)值高的質(zhì)譜條件。正離子電離模式：離子噴霧電壓5 500 V，離子源溫度650 ℃，離子源氣體1(GS1，N2)壓力400 kPa，離子源氣體2(GS2，N2)壓力450 kPa，氣簾氣體(CUR，N2)壓力137 kPa，碰撞氣(CAD)Medium。負(fù)離子電離模式：離子噴霧電壓-4 500 V，離子源溫度650 ℃，離子源氣體1(GS1，N2)壓力400 kPa，離子源氣體2(GS2，N2)壓力450 kPa，氣簾氣體(CUR，N2)壓力137 kPa，碰撞氣(CAD)Medium。

3 結(jié) 果

離子檢測(cè)的篩選參數(shù)見(jiàn)表1。對(duì)照品溶液的離子掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1～5。

4 方法學(xué)考察

表1 馬鞭草離子檢測(cè)的篩選

4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液1.0，3.0，5.0，7.0，10.0 mL，置于10 mL量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按選定的色譜條件測(cè)定峰面積。以對(duì)照品質(zhì)量濃度X(mg/L)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，線性關(guān)系良好。見(jiàn)表2。

4.2定量限 分別精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇溶解，并逐漸稀釋至信噪比S/N≥10時(shí)，即為定量限。見(jiàn)表2。

4.3重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材粉末，精密稱取6份，按“2.1.1”項(xiàng)下方法分別平行制備6份供試品溶液，按選定的色譜條件測(cè)定。結(jié)果桃葉珊瑚苷、戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、龍膽苦苷、毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為1.3%，1.6%，1.8%， 1.7%，1.9%，說(shuō)明重復(fù)性良好。

4.4精密度試驗(yàn) 取馬鞭草藥材粉末，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備1份供試品溶液，按選定的色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果桃葉珊瑚苷、戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、龍膽苦苷、毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為1.2%，1.5%，1.3%， 1.9%，1.8%，說(shuō)明精密度良好。

圖1 桃葉珊瑚苷離子掃描質(zhì)譜圖

圖2 戟葉馬鞭草苷離子掃描質(zhì)譜圖

圖3 馬鞭草苷離子掃描質(zhì)譜圖

圖4 龍膽苦苷離子掃描質(zhì)譜圖

圖5 毛蕊花糖苷離子掃描質(zhì)譜圖

表2 5種糖苷類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線

4.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品試液，在室溫下放置，分別于0，2，4，6，8，10，12，24 h測(cè)定5種糖苷類化合物的質(zhì)量濃度。結(jié)果桃葉珊瑚苷、戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、龍膽苦苷、毛蕊花糖苷質(zhì)量變化的RSD分別為1.9%，1.3%，1.7%，1.8%，1.2%，說(shuō)明樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

4.6回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已知5種糖苷類化合物質(zhì)量濃度的藥材粉末0.25 g，依次加入按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備的混合對(duì)照品溶液17 mL及80%甲醇3 mL，按“2.1.1”項(xiàng)下方法操作，按選定的色譜條件測(cè)定。結(jié)果桃葉珊瑚苷、戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、龍膽苦苷、毛蕊花糖苷的平均回收率分別為101.2%，98.63%，99.45%，101.6%，100.3%，RSD分別為1.3%，1.5%，0.8%，1.7%，1.2%(n=6)。

5 樣品測(cè)定

取不同來(lái)源馬鞭草藥材粉末各0.50 g，精密稱定，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按選定的色譜條件測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算桃葉珊瑚苷、戟葉馬鞭草苷、馬鞭草苷、龍膽苦苷、毛蕊花糖苷的質(zhì)量。見(jiàn)表3。

表3 不同來(lái)源馬鞭草藥材中5種糖苷類化合物的含量(n=3，mg/g)

6 討 論

馬鞭草藥源豐富、廉價(jià)易得，具有多種藥理活性，治療范圍廣泛，尤其在神經(jīng)保護(hù)方面，其作用機(jī)制更是多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多途徑的，對(duì)防治老年癡呆、帕金森氏病等神經(jīng)退行性病變具有很好的療效。另外，在鎮(zhèn)咳和抗動(dòng)脈粥樣硬化方面也有確切的療效。近幾年來(lái)，本實(shí)驗(yàn)小組一直致力于馬鞭草的研究，先前在應(yīng)用HPLC法測(cè)定馬鞭草中戟葉馬鞭草苷和馬鞭草苷[6]的過(guò)程中，也嘗試過(guò)HPLC法測(cè)定5種糖苷的含量，但未獲成功，可能是由于儀器的靈敏度限制所致。

本實(shí)驗(yàn)選定用20倍80%甲醇超聲處理45 min來(lái)制備樣品，是因?yàn)橄惹皩?duì)不同濃度(20%，40%，60%，80%及100%)甲醇的提取率、不同超聲提取時(shí)間(15，30，45，60 min)以及超聲處理和回流提取兩種方式等進(jìn)行了比較，從而采取的最佳方法。

樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，各產(chǎn)地藥材5種糖苷的含量差異較大，本實(shí)驗(yàn)首次建立同時(shí)測(cè)定馬鞭草中5種糖苷含量的方法，為科學(xué)評(píng)價(jià)與有效控制馬鞭草藥材質(zhì)量提供了新手段。該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、靈敏度高、重復(fù)性好，可作為馬鞭草藥材的鑒別和質(zhì)量控制方法。

[1] 中國(guó)藥典委員會(huì). 中國(guó)藥典(一部)[S]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：49

[2] 任非，袁志芳，段坤峰，等. 馬鞭草提取物的鎮(zhèn)咳、抗炎和祛痰作用研究[J]. 中國(guó)藥房，2013，24(31)： 2887-2890

[3] 任非，段坤峰，付穎，等. 馬鞭草鎮(zhèn)咳有效部位化學(xué)成分的研究[J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志， 2013，33(6)：445-449

[4] Teborg D，Junior P. Iridoid glucosides from penstemon nitidus[J]. Planta Med，1991，57(2)：184-186

[5] 張濤，阮金蘭，呂子敏. 馬鞭草環(huán)烯醚萜苷類成分的研究[J]. 中草藥，2000，31(10)：721-723

[6] 袁志芳，段坤峰，張?zhí)m桐，等. HPLC法同時(shí)測(cè)定馬鞭草中馬鞭草苷和戟葉馬鞭草苷[J]. 中草藥，2009，40(5)：818-820

Simultaneous determination of five glycosides in Verbena Officinalis L. by HPLC-MS/MS

WANG Hua1, REN Fei2, DUAN Kunfeng1, CHEN Xuejun1, YUAN Zhifang3

(1.The Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei, China; 2.The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, Hebei, China; 3.Pharmacy School of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, Hebei, China)

Objective It is to establish a HPLC-MS/MS method for the simultaneous determination of aucubin, hastatoside, verbenalin, gentiopicroside and verbascoside in Verbena officinalis L. Methods All separations were carried out on a Waters SunfireTM C18 column (4.6mm×150mm, 5μm) with the mixture of acetonitrile-water containing 0.1% formic acid (25∶75→40∶60) as mobile phase by gradient elution at the flow rate of 0.8 mL/min and injection volume was 5 μL. The temperature of column was 30℃. Detection was performed with multiple reactions monitoring (MRM) by using electrospray ionization (ESI) source. The production transitions were monitored at m/z 167.2→m/z 149.1, m/z 243.2→m/z 225.2, m/z 227.2→m/z 195.2, m/z 195.2→m/z 177.2 (ESI+ mode) for aucubin, hastatoside, verbenalin, gentiopicroside and m/z 461.3→m/z 161.0 (ESI-mode) for verbascoside. Results The linearity was good for aucubin, hastatoside, verbenalin, gentiopicroside and verbascoside in the range of 120-1 200, 10 000-100 000, 5 000-50 000, 1.2-12, 510-5 100 ng/mL. The average recoveries were 101.2%, 98.63%, 99.45%, 101.6% and 100.3% respectively. Conclusion This method is simple, accurate and reproducible. It can set the basis for reasonable application and quality control for Verbena Officinalis L.

HPLC-MS/MS; aucubin; hastatoside; verbenalin; gentiopicroside; verbascoside; Verbena Officinalis L.

王華，女，主管藥師，研究方向?yàn)樗幬镔|(zhì)量控制。

任非，副主任藥師，E-mail:renfei680811@sina.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.03.003

R969.4

A

1008-8849(2015)03-0235-04

2013-10-30