小腸黏膜下層與脫細(xì)胞羊膜促進(jìn)大鼠損傷皮膚修復(fù)及血管形成的作用

王 飛，魏紅芳，胡成棟，張恩錄，高愛芹，王 瑞，李東風(fēng)

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

小腸黏膜下層與脫細(xì)胞羊膜促進(jìn)大鼠損傷皮膚修復(fù)及血管形成的作用

王 飛，魏紅芳，胡成棟，張恩錄，高愛芹，王 瑞，李東風(fēng)

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

目的 探討小腸黏膜下層及脫細(xì)胞羊膜在促進(jìn)大鼠皮膚損傷修復(fù)和血管形成中的作用。方法 取SD大鼠60只，于每只背部?jī)蓚?cè)各做一個(gè)1.5 cm×1.5 cm大小全層皮膚缺損，至深筋膜。將大鼠隨機(jī)分為3組，A組創(chuàng)面采用小腸黏膜下層細(xì)胞覆蓋，B組創(chuàng)面以雙層脫細(xì)胞羊膜覆蓋，C組創(chuàng)面以等滲生理鹽水紗布覆蓋。觀察各組創(chuàng)面愈合情況，在1～4周時(shí)將動(dòng)物處死并取材，HE染色下觀察并計(jì)數(shù)炎癥細(xì)胞數(shù)，免疫組化SP法染色下觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果 1周時(shí)，與C組相比，A、B組敷料與缺損創(chuàng)面貼合緊密，與紗布無粘連，更換敷料時(shí)創(chuàng)面無滲血。各時(shí)間點(diǎn)，A、B組創(chuàng)面組織內(nèi)炎癥因子數(shù)均明顯低于C組(P均<0.05)，而A組與B組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。1～3周時(shí)，A、B組血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)明顯高于C組(P均<0.05)，而A組與B組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 應(yīng)用小腸黏膜下層細(xì)胞及脫細(xì)胞羊膜來覆蓋皮膚缺損創(chuàng)面，均可減少創(chuàng)面的出血及滲出，減輕局部炎癥反應(yīng)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及新生血管形成，具有加快創(chuàng)面愈合的作用。

小腸黏膜下層；脫細(xì)胞羊膜；皮膚；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子

完整的皮膚具有維持肌肉軟組織內(nèi)的水分，避免營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)丟失的作用，同時(shí)作為生物學(xué)屏障，能有效抵御細(xì)菌入侵從而保護(hù)機(jī)體免受感染[1]。當(dāng)皮膚缺損后，臨床上可用多種方法及替代組織來對(duì)缺損區(qū)域處進(jìn)行修復(fù)，從而維持機(jī)體的相對(duì)完整性。小腸黏膜下層(small intestine submucosa，SIS)是天然細(xì)胞外基質(zhì)類生物衍生材料，通常由豬小腸制備，人工處理后的SIS主要由Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及少量Ⅴ、Ⅵ膠原構(gòu)成，具有無免疫原性、抗微生物活性、優(yōu)良的生物力學(xué)性能，并能促進(jìn)組織再生，是組織工程優(yōu)良的生物支架材料，可用于心肌、骨、血管及皮膚組織缺損的修復(fù)[2-3]。脫細(xì)胞羊膜(human acellular amniotic membrane,HAM)作為組織脫細(xì)胞材料的典型代表，在具有良好生物相容性的同時(shí)抗原性顯著降低，其作為有生物活性的一種細(xì)胞-支架復(fù)合體，廣泛用于缺損組織的修復(fù)，具有極大的應(yīng)用前景。筆者觀察了HAM和SIS對(duì)全層皮膚缺損SD大鼠創(chuàng)面和血管形成的影響，以期為臨床選取一種更有效的生物支架材料提供依據(jù)。現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1SIS的制備 取健康豬的空腸長(zhǎng)約10 cm，沖凈，機(jī)械法去除外面的漿膜層與肌層，翻轉(zhuǎn)后去除黏膜層，縱向切開黏膜下層基質(zhì)，浸泡于100 mmol/L EDTA與10 mmol/L NaOH(pH 11～12)溶液中，去離子水沖凈，再浸泡于1 mol/L HCl與1 mol/L NaCl溶液中6～8 h，去離子水沖凈，在含1 mol/L NaCl的PBS溶液(pH 7～7.4)中浸泡16 h，去離子水沖凈，在PBS溶液中浸泡2 h，去離子水沖洗2 h，0.2%過氧乙酸(含5%無水乙醇)消毒30 min，用含0.05%疊氮化鈉的PBS溶液清洗2 h，用2.5×10-5Gy γ射線照射。

1.2HAM的制備 取剖宮產(chǎn)孕婦的羊膜，生理鹽水沖洗血跡后反復(fù)漂洗，以0.2%戊二醛交聯(lián)，0.5% SDS反復(fù)震蕩后再以0.25%的胰酶消化4 h，漂洗并冷凍干燥，備用。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及儀器 選取2～3月齡，體質(zhì)量在200～250 g的SD大鼠60只，雌雄不限，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，合格證號(hào)：XS-091112。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的操作及處理符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自上海威奧生物科技有限公司。

1.4方法 以0.4%戊巴比妥鈉行腹腔注射麻醉，麻醉生效后局部消毒，在大鼠背部?jī)蓚?cè)分別切除部分全層皮膚，達(dá)深筋膜，直徑在1.3 cm左右，建立全層皮膚損傷模型。隨機(jī)將造模后的大鼠分為3組，每組20只。A組大鼠背部皮膚缺損處外敷SIS并用無菌紗布包裹，B組大鼠皮膚缺損處外敷雙層HAM并以無菌紗布包裹，C組用等滲生理鹽水沖洗創(chuàng)面后以無菌紗布覆蓋。均2～3 d換紗布1次，觀察創(chuàng)面愈合情況。

1.5觀測(cè)指標(biāo)

1.5.1創(chuàng)面局部愈合情況 術(shù)后更換敷料時(shí)觀察皮膚缺損處創(chuàng)面有無紅腫、滲出及出血等情況。

1.5.2創(chuàng)面愈合率 術(shù)后2，3，4周各處死大鼠5只，觀察并測(cè)量各組缺損處創(chuàng)面上皮化組織形成情況。根據(jù)公式計(jì)算[4]：創(chuàng)面愈合率(%)=(最初創(chuàng)面面積-未愈創(chuàng)面面積)/最初創(chuàng)面面積×100%。

1.5.3組織學(xué)觀察 術(shù)后1周、2周、3周、4周時(shí)各處死5只大鼠，在無菌條件下從缺損中央處取材，經(jīng)4%多聚甲醛固定1 d后制成石蠟組織切片。HE染色后顯微鏡下觀察。取隨機(jī)的近表面視野，放大倍數(shù)400倍，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)炎癥細(xì)胞數(shù)目(包括嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞)，于每張切片上取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野下炎癥細(xì)胞的數(shù)目，取平均值。以兔抗人相關(guān)抗原為一抗，按免疫組化SP法染色，胞漿和細(xì)胞膜呈現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性，可視為血管內(nèi)皮細(xì)胞(計(jì)數(shù)方法與炎癥細(xì)胞相同)。

2 結(jié) 果

2.1不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合情況 術(shù)后3 d，3組創(chuàng)面均有少許滲出物，A、B組覆蓋的材料與紗布無粘連，與皮膚缺損處創(chuàng)面貼附緊密；C組創(chuàng)面與紗布粘連緊密，更換紗布時(shí)創(chuàng)面有出血。術(shù)后1周，3組創(chuàng)面均較前變淺，A、B組缺損處創(chuàng)面干潔，無炎性滲出，且與覆蓋的紗布無粘連；C組則有較多滲出物，掀開紗布后創(chuàng)面滲血明顯，創(chuàng)面肉芽組織新鮮生長(zhǎng)。術(shù)后2周，3組創(chuàng)面明顯變淺，幾乎與正常皮膚持平，邊緣有新鮮上皮組織向創(chuàng)面內(nèi)生長(zhǎng)，此時(shí)C組創(chuàng)面揭開后仍滲血。術(shù)后3周時(shí)，因上皮組織的長(zhǎng)入，缺損創(chuàng)面進(jìn)一步縮小，A、B組所覆蓋的SIS和HAM邊緣翹起，部分脫落，顯露新鮮的上皮化創(chuàng)面；C組創(chuàng)面仍少量滲血，創(chuàng)緣部分上皮化。術(shù)后4周，A、B組創(chuàng)面完全愈合，C組創(chuàng)面結(jié)痂，部分愈合。

2.2創(chuàng)面愈合率 術(shù)后2周、3周、4周時(shí)，A、B組創(chuàng)面愈合率均明顯高于C組(P均<0.05)，但A、B組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)3組創(chuàng)面愈合率比較

注：①與C組比較，P<0.05。

2.3炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù) 術(shù)后1周時(shí)，各組創(chuàng)面炎癥細(xì)胞數(shù)均較多，且C組較A、B組更高(P均<0.05)。術(shù)后2周、3周、4周時(shí)，各組炎癥細(xì)胞數(shù)因上皮細(xì)胞的不斷生長(zhǎng)及創(chuàng)面的逐步愈合均呈下降趨勢(shì)；組間比較發(fā)現(xiàn)，C組炎癥細(xì)胞數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)均高于A、B組(P均<0.05)，但A組與B組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)3組炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)比較個(gè)/HP)

注：①與C組比較，P<0.05。

2.4血管內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù) 術(shù)后隨著時(shí)間的推移及組織修復(fù)的逐步完成，各組血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目呈逐漸減少趨勢(shì)。術(shù)后1周、2周、3周時(shí)，A、B組血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)高于C組(P均<0.05)，但A組與B組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在術(shù)后4周時(shí)，3組血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)3組血管內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)比較個(gè)/HP)

注：①與C組比較，P<0.05。

3 討 論

SIS作為一種淺白色薄膜狀細(xì)胞外基質(zhì)生物材料，已廣泛用于軟骨、肌腱、泌尿系統(tǒng)、心肌和血管等組織的修復(fù)。通常借助機(jī)械方法，將豬小腸的黏膜層和肌層去除，制成厚度約為100 μm的膜性組織，保留了天然細(xì)胞外基質(zhì)的三維立體結(jié)構(gòu)，空隙率在60%左右，孔徑大小為80 nm[3]。它具有良好的生物相容性，降解速率可控，含有多種生長(zhǎng)因子，植入體內(nèi)或覆蓋于創(chuàng)面時(shí)可誘導(dǎo)細(xì)胞的黏附和增殖，促進(jìn)組織再生，中間的孔隙和所具有的機(jī)械強(qiáng)度可對(duì)新生組織形成有力的支撐[5]。HAM多來源于胎膜，可通過機(jī)械法、化學(xué)法和垢劑-酶消化法來進(jìn)行制備，去除上皮細(xì)胞層、海綿層和纖維細(xì)胞層等組織結(jié)構(gòu)，只保留基底膜、致密層。已有研究表明，HAM具有纖維粘連素、膠原蛋白、蛋白多糖及多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)細(xì)胞黏附、遷移、增殖、分化，除可防止組織粘連外,還具有很強(qiáng)的組織缺損修復(fù)功能[6]。此外，HAM還含有多種蛋白酶抑制劑，可抑制相應(yīng)的蛋白酶發(fā)揮抗炎作用。SIS和HAM具有很多相似的結(jié)構(gòu)，如含有豐富的生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)上皮細(xì)胞遷移、增殖并阻止上皮細(xì)胞凋亡等作用[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，A組和B組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率均明顯高于C組，表明采用HAM和SIS覆蓋皮膚缺損部位可有效促進(jìn)并加快創(chuàng)面的愈合；A組和B組創(chuàng)面愈合率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明HAM和SIS均有促進(jìn)創(chuàng)面上皮化的作用，這一促進(jìn)上皮生長(zhǎng)的具體機(jī)制目前仍不清楚，可能與生物膜內(nèi)含有較豐富的表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子有關(guān)[5，8]。定期換藥時(shí)，HAM和SIS與紗布不易黏附，創(chuàng)面不易滲血；術(shù)后1周時(shí)，A、B組創(chuàng)面就已干燥無滲出，但C組術(shù)后2周時(shí)創(chuàng)面仍有少量滲血，這足以說明HAM和SIS均具有有效防止組織粘連的作用。

HAM和SIS有抑制創(chuàng)面微生物生長(zhǎng)的作用，可明顯抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)和繁殖[9]。在本研究中，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)A、B組創(chuàng)面的炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯少于C組，這可能與2種生物膜均可保持創(chuàng)面相對(duì)更干燥，從而營(yíng)造了一個(gè)不利于細(xì)菌生長(zhǎng)的環(huán)境有關(guān)，亦可能與2種生物材料本身所具有的抑制細(xì)菌繁殖的作用有關(guān)[9]。另外，在創(chuàng)面愈合的初期(1～3周)階段，HAM和SIS均有明顯促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用?？赡苁瞧渌械睦w維黏連蛋白可促進(jìn)并調(diào)控細(xì)胞的黏附、遷移和增殖能力，血管內(nèi)皮細(xì)胞能更有效地穿透生物膜并進(jìn)行生長(zhǎng)和增殖，而且這種新生血管具有很好的收縮和擴(kuò)增功能[10]。到創(chuàng)面愈合后期(4周)時(shí)，這種促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用明顯減弱，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，HAM和SIS均可促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，同時(shí)減少創(chuàng)面的出血及滲出，減輕局部炎癥反應(yīng)，有效促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及新生血管的形成。

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The function of small intestinal submucosa and acellular amniotic in promotion reparation and vascularization of injured skin in rat

WANG Fei, WEI Hongfang, HU Chengdong, ZHANG Enlu, GAO Aiqin, WANG Rui, LI Dongfeng

(The Central Hospital of Handan City, Handan 056001, Hebei, China)

Objective It is to approach the function of small intestinal submucosa and acellular amniotic in promotion reparation and vascularization of injured skin in rat. Methods Two full-thickness skin defects that about 1.5 cm×1.5 cm were created on both sides of the dorsum of the 60 SD rats. Then the animals were randomly divided into 3 groups. The skin defects was covered by the small intestinal submucosa in Group A, by acellular amniotic membrane in Group B and by physiological saline gauze in group C. The wound healing condition was observed in all groups. After 1-4 weeks, the sample was harvested for histological evaluation. Results Compared with group C at 1 week, the other two groups had a more tightly wound adherence, and with little bleeding when change the dressing (P<0.05). At each time point, Group A and B had a lower level inflammatory cytokines and a higher vascular endothelial cells than Group C (allP<0.05). However, there was no significant difference between Group A and B(P>0.05). Conclusion The small intestinal submucosa and acellular amniotic can improve the wound healing rate, reduce the inflammation and promote endothelial cells proliferation and angiogenesis.

small intestinal submucosa; acellular amniotic; skin; vascular endothelial growth factor

王飛，男，碩士，主治醫(yī)師，從事皮膚軟組織缺損修復(fù)的基礎(chǔ)研究。

邯鄲市科技計(jì)劃項(xiàng)目(1223108090-3)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.03.002

R-332

A

1008-8849(2015)03-0232-03

2014-08-10