不同標(biāo)本及組合對熒光探針法診斷兒童手足口病的價(jià)值評(píng)估

秦 濤(重慶市九龍坡區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科 400051)

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·論 著·

不同標(biāo)本及組合對熒光探針法診斷兒童手足口病的價(jià)值評(píng)估

秦 濤(重慶市九龍坡區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科 400051)

目的 評(píng)估不同臨床標(biāo)本及組合在實(shí)驗(yàn)室采用熒光探針法診斷兒童手足口病的價(jià)值。方法 收集680例臨床診斷為手足口病的咽拭子和肛拭子標(biāo)本，其中有潰瘍表征的標(biāo)本223例，有皰疹液的標(biāo)本522例，有腦膜炎癥狀的血清和腦脊液標(biāo)本76例，采用熒光探針法檢測腸道病毒腸道病毒71型(EV71)、柯薩奇病毒A組16型(CA16)及通用型。結(jié)果 單一標(biāo)本腸道病毒通用型咽拭子陽性檢出率(70.29%)最高，其余依次為肛拭子(65.15%)，皰疹拭子(63.03%)，潰瘍拭子(43.95%)，腦脊液(2.63%)，血清(1.32%)；對于有全套標(biāo)本的患兒咽拭子確診率達(dá)74.15%，咽拭子與皰疹拭子組合確診率達(dá)91.7%，咽拭子與肛拭子組合確診斷率為89.26%，全套標(biāo)本組合將診斷率提升至95.61%；單獨(dú)一個(gè)的皰疹拭子與潰瘍拭子診斷率分別為63.03%和43.95%，當(dāng)皰疹拭子與潰瘍拭子為2個(gè)診斷率分別為66.67%和47.09%，當(dāng)皰疹拭子與潰瘍拭子為3個(gè)診斷率分別為67.24%和47.98%，大于等于4個(gè)時(shí)診斷率將不再提升。結(jié)論 對手足口病標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測時(shí)，首選咽拭子標(biāo)本，將咽拭子與其他標(biāo)本組合將明顯提升診斷率；血清和腦脊液標(biāo)本對臨床診斷是否感染手足口病不是必須的選擇；對于暴發(fā)手足口病采集全套咽拭子、肛拭子、皰疹拭子、潰瘍拭子標(biāo)本十分必要；采集皰疹拭子與潰瘍拭子標(biāo)本時(shí)同時(shí)采集2～3個(gè)拭子是較為可靠的做法。

手足口病； 標(biāo)本； 熒光探針法

手足口病(HFMD)是近年一種常見的發(fā)熱性疾病；多發(fā)于嬰幼兒中，表現(xiàn)為皮膚與口腔黏膜病變、斑丘疹或皰疹，通常出現(xiàn)在手掌或腳掌上，也可波及臀部、肘部及膝蓋?？谇粷兪亲顬槌Ｒ姷酿つふ?，某些患者還會(huì)出現(xiàn)皰疹性咽峽炎。2008年5月我國衛(wèi)生部將手足口病納入法定報(bào)告的丙類傳染病，而且已成為我國各類傳染病中發(fā)病數(shù)最高的丙類傳染病[1]。腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A組16型(CA16)均為引發(fā)HFMD的主要病原體。為了評(píng)估不同標(biāo)本及組合使用熒光探針法檢測HFMD的價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)室對臨床診斷為HFMD的患兒根據(jù)表征不同采集了咽拭子、肛拭子、潰瘍面拭子、皰疹拭子及血清、腦脊液進(jìn)行檢測，以期發(fā)現(xiàn)更優(yōu)化的標(biāo)本組合，從而為臨床HMFD的診斷及日常病原學(xué)監(jiān)測提供準(zhǔn)確有效依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月至2014年3月本院收治的HFMD患兒680例，其中男399例，女281例，年齡3～125個(gè)月，平均年齡(30±8)個(gè)月。當(dāng)兒童出現(xiàn)以下(至少1種)發(fā)病征象時(shí)，即被臨床診斷為HFMD：手掌和(或)腳掌出現(xiàn)斑丘疹和(或)水皰疹；口腔出現(xiàn)小水泡或潰瘍，或皰疹性咽峽炎(又稱為多發(fā)性口腔潰瘍，以口腔后部為主)[2]。

1.2 標(biāo)本采集 采集咽拭子時(shí)，需配合使用壓舌器；取樣時(shí)，用輕柔而靈敏的動(dòng)作擦拭咽后部及兩側(cè)(不能觸碰舌頭與峽黏膜)。采集直腸拭子標(biāo)本時(shí)，先將拭子插入肛門，然后旋轉(zhuǎn)擦拭肛門周圍及直腸壁。仔細(xì)檢查患兒的皮膚上是否有水皰，口腔內(nèi)是否有潰瘍；若有，則用棉簽擦拭至少1個(gè)(最大或最容易接觸的)病變部位，以采集皰疹拭子和(或)潰瘍拭子標(biāo)本。在采集皰疹拭子時(shí)，需先用0.9%的無菌生理鹽水輕柔地擦拭取樣部位；禁止使用酒精，有可能會(huì)殺滅病毒。使用一根無菌針刺破水皰，然后再用拭子吸取水皰液；也可用拭子輕柔地在水皰上翻滾擠壓，以擠出水皰液。若疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷的患兒伴有發(fā)熱史、發(fā)熱癥狀(體溫大于或等于38 ℃)或以下癥狀(至少1個(gè))時(shí)，采集其腦脊液和血清標(biāo)本。(1)外觀呈現(xiàn)毒性或病變；(2)再發(fā)性嘔吐(至少兩次)；(3)心跳過速(心率大于150次/分)；(4)呼吸急促；(5)神志衰減(易怒、嗜睡、精神欠佳、昏迷)；(6)四肢無力、假性腦膜炎(頸強(qiáng)直或克氏征)或癲癇。采樣后，立即將標(biāo)本置于-70 ℃冰箱中。如在正常工作時(shí)間之外采樣，無法即刻將標(biāo)本置于-70 ℃的冷藏環(huán)境中時(shí)，可先將臨床標(biāo)本冷藏在4 ℃的環(huán)境中過夜，第2天盡快將標(biāo)本置入-70 ℃冰箱中。

1.3 熒光探針法檢測 EV71型、CAl6型和腸道病毒通用型核酸檢測試劑盒為中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司產(chǎn)品，標(biāo)本處理與一步法熒光探針法RT-PCR檢測具體操作參考說明書執(zhí)行。

2 結(jié) 果

2.1 不同標(biāo)本的腸道病毒陽性檢測出率 腸道病毒通用型熒光探針法的核酸擴(kuò)增體系包含了EV71和CA16的擴(kuò)增引物，因此通用型的陽性率可作為不同標(biāo)本的陽性檢出率指標(biāo)，通用型咽拭子(70.29%)>肛拭子(65.12%)>皰疹拭子(63.03%)>潰瘍拭子(43.95%)，其中咽拭子陽性檢出率最高。680例患兒咽拭子標(biāo)本中197例(28.97%)為EV71陽性，209例(30.74%)為CA16陽性，其中有23例EV71合并CA16陽性。本次研究根據(jù)患兒的臨床表征進(jìn)行了血清和腦脊液檢查，受測患兒共計(jì)76例；熒光探針法血清檢出病毒的僅為1例，腦脊液檢出病毒僅2例。見表1。

表1 不同類型標(biāo)本的腸道病毒陽性檢出率

表2 皰疹拭子和潰瘍拭子的采樣數(shù)量與陽性

2.2 標(biāo)本組合分析 680例受測患兒中，同時(shí)具備皰疹與潰瘍表征的患兒為205例，這一分析的研究對象僅為具備全套標(biāo)本的患兒(血清和腦脊液陽性檢出率非常低，不進(jìn)一步作為本分析標(biāo)本)。單獨(dú)使用咽拭子確診了152例(74.15%)；單獨(dú)使用皰疹拭子確診了138例；單獨(dú)使用直腸拭子確診了134例；單獨(dú)使用潰瘍拭子確診了92例，咽拭子的陽性檢測率仍是最高，故將咽拭子作為第1標(biāo)本。若同時(shí)加入皰疹拭子進(jìn)行檢測，則腸道病毒通用型陽性增至179例；若同時(shí)加入直腸拭子進(jìn)行檢測，腸道病毒通用型陽性為174例；若同時(shí)加入潰瘍拭子進(jìn)行檢測，腸道病毒通用型陽性為155例。在此基礎(chǔ)上，可將皰疹拭子作為第2標(biāo)本，此時(shí)加入直腸拭子結(jié)果通用型陽性數(shù)為188例；加入潰瘍拭子結(jié)果則為183例。以此類推，加入直腸拭子作為第3標(biāo)本，加入潰瘍拭子作為第4標(biāo)本。得到通用型腸道病毒陽性數(shù)為196例，診斷率將升至95.61%(196/205)。

2.3 皰疹拭子和潰瘍拭子的采樣數(shù)量與陽性數(shù)量之間的關(guān)系 檢測中為522例出現(xiàn)水皰疹的HFMD患兒采集了至少1個(gè)(平均值為2個(gè)，范圍1～10個(gè))皰疹拭子；為223例出現(xiàn)潰瘍的HFMD患兒采集了至少1個(gè)(平均值為2個(gè)，范圍1～6個(gè))潰瘍疹拭子。檢測結(jié)果顯示，63.03%的單次皰疹拭子檢測呈陽性，43.95%的單次潰瘍拭子檢測呈陽性。見表2。

3 討 論

自1997年以來，HFMD在亞太地區(qū)的多次爆發(fā)，帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失與社會(huì)負(fù)擔(dān)[3-5]。部分患兒可能并發(fā)病毒性腦炎、腦脊髓炎，個(gè)別患兒病情發(fā)展迅猛，繼發(fā)腦干腦炎、神經(jīng)源性腦水腫、肺出血，嚴(yán)重者甚至發(fā)生死亡[6]。為了明確HFMD病原體感染源，臨床檢驗(yàn)需面對各種不同的標(biāo)本，并從中選出最為有效的檢測方案。

近年來，大部分關(guān)于HFMD感染的研究手段大多為糞便培養(yǎng)與咽拭子分析[5-7]。結(jié)果顯示，后者的靈敏度更高，咽拭子檢測結(jié)果呈陽性的比例為受測患兒的90%～95%；而糞便培養(yǎng)結(jié)果呈陽性的比例則僅為受測患兒的40%～65%，且少見針對HFMD大標(biāo)本進(jìn)行系統(tǒng)性研究[7-8]。2000年，新加坡爆發(fā)了大規(guī)模的HFMD；當(dāng)時(shí)有人對175例HFMD患者進(jìn)行了調(diào)查研究，其研究報(bào)告指出，病毒診斷率由高到低依次為：直腸拭子、糞便標(biāo)本、皰疹拭子、咽拭子。但是，本研究結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)，對于大部分患兒而言，咽拭子是陽性診斷率最高的單一標(biāo)本：在205例具備全套標(biāo)本的患兒中，其陽性診斷率為152例(74.15%)；在680例受測患兒中，其陽性診斷率為478例(70.29%)。

HFDM患兒的皰疹一般出現(xiàn)在起病初期，通常幾天后消失，應(yīng)提示臨床選擇最佳的檢測時(shí)機(jī)。有學(xué)者曾從4例患兒的皰疹拭子中分離出了病毒[8]。在本實(shí)驗(yàn)室檢測的病例中，有近一半患兒出現(xiàn)了皮膚皰疹，研究結(jié)果證明，皰疹拭子檢測有較高的陽性檢出率。在出現(xiàn)皰疹表征的患兒中，皰疹拭子的診斷率列第2位，205例接受檢測患兒的陽性檢出率為138例(67.31%)，相對無菌的皰疹液在病原學(xué)診斷上也更有價(jià)值。

為了找出標(biāo)本組合的最優(yōu)數(shù)量，在采集皰疹拭子時(shí)，可試著采集多個(gè)單獨(dú)的皰疹拭子并進(jìn)行疊加。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)為每位受測患兒采集1個(gè)皰疹拭子時(shí)，陽性檢出率為63.03%；當(dāng)該數(shù)量增至2個(gè)時(shí)，陽性檢出率達(dá)到66.07%；當(dāng)該數(shù)量增至3個(gè)時(shí)，陽性檢出率升至67.04%，當(dāng)大于等于4個(gè)時(shí)陽性率不再增加。因此建議，在采集皰疹液時(shí)，1個(gè)皰疹拭子應(yīng)同時(shí)擦拭吸取2～3個(gè)水皰的皰疹液。這種做法可以使病毒檢出率最大化，而無需增大標(biāo)本處理量。

本研究報(bào)告顯示，血清和腦脊液的病毒檢出率較低，76例合并無菌性腦膜炎的HFMD患兒中僅發(fā)現(xiàn)血清檢出1例，腦脊液檢出2例，這一發(fā)現(xiàn)與有關(guān)報(bào)道相吻合[9]。

此外，本研究還逐一對單個(gè)標(biāo)本進(jìn)行了檢查，以期發(fā)現(xiàn)最有效的標(biāo)本組合。具體方法為：確定一種首選標(biāo)本，再根據(jù)不同臨床表現(xiàn)組合其他類型的標(biāo)本，從而提高診斷陽性率。在HFMD的大規(guī)模流行期，在為患兒診斷時(shí)最好同時(shí)采集(至少)2個(gè)標(biāo)本——咽拭子與另一其他類型拭子。若患兒未出現(xiàn)皰疹表征，則第2標(biāo)本應(yīng)為直腸拭子；若患兒出現(xiàn)了皰疹表征，則第2標(biāo)本應(yīng)為皰疹拭子(采集至少2個(gè)水皰的水皰液)。為患兒采集全套標(biāo)本，在檢測中根據(jù)階梯分析法，從最有效的標(biāo)本著手，進(jìn)行合理的組合檢測，可以更加準(zhǔn)確地為重癥病例提供病原學(xué)診斷依據(jù)。

[1]朱啟镕，曾玫.手足口病的流行現(xiàn)狀及挑戰(zhàn)[J]．微生物與感染，2012，7(2)：82-88．

[2]衛(wèi)生部.手足口病預(yù)防控制指南(2009版)[J].全科醫(yī)學(xué)臨床與教育,2010,8(2):125-127.

[3]何顏霞,付丹,操德智,等.重癥手足口病分組監(jiān)護(hù)治療80例分析[J].中華兒科雜志,2009,47(5):338-343.

[4]毛國順，羅玲，劉曉琳，等．手足口病輕癥與重癥患者臨床特征比較[J]．中華傳染病雜志，2008，26(7)：387-390．

[5]初艷慧,劉瀟瀟,孫小宇，等.重癥手足口病例的臨床特征和流行病學(xué)分析[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2014,21(9):38-39.

[6]李麗.手足口病普通和重癥病例臨床特征及病原學(xué)研究[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2011，27(14)：2660-2662.

[7]楊曉紅，吳茜，溫柏平,等.2010年昆明地區(qū)兒童手足口病病原分子流行病學(xué)調(diào)查研究[J].中國當(dāng)代兒科雜志，2012,14(3):163-166.

[8]Chan LG,Parashar UD,Lye FG,et al.Deaths of children during an outbreak of hand,foot,and mouth disease in Sarawak,Malaysia:clinical and pathological characteristics of the disease.For the Outbreak Study Group[J].Clin Infect Dis,2000,31(3):678-683.

[9]李娟娟,蘇明,王玉肖.不同標(biāo)本及其組合在手足口病診斷中的意義[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2014,21(1):1006-1009.

Evaluation on value of different samples and their combination in diagnosis of hand-foot-mouth disease by fluorescence probe method

QINTao

(DepartmentofChinicalLaboratory,JiulongpoDistrictMaternalandChildHealthCareHospital,Chongqing400051,China)

Objective To evaluate the value of different clinical samples and their combination in the diagnosis of hand-foot-mouth disease(HFMD) by adopting fluorescence probe method.Methods 680 throat swabs and rectal swabs of clinically diagnosed HFMD were collected,in which 223 cases had ulcer symptom,522 cases had herpes liquid and 76 cases of serum and cerebrospinal fluid had meningitis symptoms.Then enterovirus EV71,CA16 and universal enterovirus were detected by adopting the fluorescence probe method.Results The positive rate of universal enterovirus in single throat swabs was 70.29%,showing the highest detection rate,followed by the rectal swab(65.15%),herpes swab(63.05%),ulcer swab(43.95%),cerebrospinal fluid(2.63%) and serum(1.32%);the definite diagnosis rate of throat swab with whole set of samples reached 74.15%,which of the combination of throat swab plus herpes swabs reached 91.7%,which of the combination of throat swab and rectal swab reached 89.26%,while which of whole set of samples was increased to 95.16%;the diagnosis rates of single herpes swab and ulcer swab were 63.03% and 43.95% respectively,while which of two herpes swabs and two ulcer swabs were 66.67% and 47.09%respectively,which of three herpes swabs and three ulcer swabs were 67.24% and 47.98% respectively,while which of 4 or more swabs each was not upgraded.Conclusion In conducting the laboratory detection of HFMD samples,the throat swab is the first choice,the combination of throat swab with other samples would significantly increase the diagnosis rate;serum and cerebrospinal fluid samples are not necessary choice for clinically diagnosing whether HFMD infection.It is very necessary to collect the whole set of throat swab,rectal swab,herpes swab and ulcer swab for the outbreak of HFMD,simultaneously collecting 2-3 herpes swabs and ulcer swabs is a relatively reliable way.

HFMD; samples; fluorescence probe method

秦濤，女，主管技師，本科，主要從事臨床免疫檢驗(yàn)方面的研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.16.052

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1672-9455(2015)16-2425-03

2015-02-22

2015-05-08)