血小板裂解液差異蛋白在原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷中的臨床應(yīng)用研究*

吳鵬強，湯計瑞，韓麗英(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科，四川瀘州 646000)

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·論 著·

血小板裂解液差異蛋白在原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷中的臨床應(yīng)用研究*

吳鵬強，湯計瑞，韓麗英△(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院血液科，四川瀘州 646000)

目的 通過對原發(fā)免疫性血小板減少癥(ITP)患者血小板裂解液差異蛋白的研究,了解其與ITP發(fā)病的關(guān)系,為ITP的診斷建立一種簡便快速、靈敏度高、特異性好的實驗方法。方法 應(yīng)用表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)檢測64例ITP患者及42例健康者血小板裂解液，獲得血小板蛋白質(zhì)譜圖，篩選出差異蛋白，結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)，建立ITP診斷模型。結(jié)果 質(zhì)荷比(m/z)為3 549.17、7 678.09的蛋白在ITP組中高表達，質(zhì)荷比為5 328.29、7 894.32的蛋白低表達。診斷模型的靈敏度93.3%，特異度82.6%。結(jié)論 基于血小板蛋白質(zhì)譜建立的ANN模型可能對ITP的診斷具有一定的臨床價值。

原發(fā)免疫性血小板減少癥； 蛋白質(zhì)組學(xué)； 表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜

原發(fā)免疫性血小板減少癥(ITP)是一種常見的由抗血小板膜抗體導(dǎo)致外周血小板破壞而引起的出血性疾病，2007年國際工作組(IWG)召集ITP專家在意大利舉行會議，強調(diào)其為免疫機制所介導(dǎo)。成人發(fā)病率為1/20 000～1/10 000，臨床上以皮膚、黏膜及內(nèi)臟出血較多見。在ITP發(fā)病過程中血小板膜抗原性發(fā)生改變是疾病的根本所在，檢測血小板表面的抗原，尋找差異蛋白，可能更易了解疾病的本質(zhì)特征。由于血小板無細(xì)胞核，與其他有核細(xì)胞及血清相比蛋白成分簡單，因此檢測血小板裂解液可以直接獲得ITP的疾病特征，避免血清中高豐度蛋白質(zhì)的干擾。采用表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)-蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測ITP患者和健康者血小板裂解液，在血小板蛋白質(zhì)水平全景式比較指紋圖譜，尋找差異蛋白,作為ITP診斷的生物標(biāo)志物，進一步完善ITP診斷模型。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年10月至2012年11月本院血液科收治的按IWG2009年ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為ITP的住院患者,所有患者均為初診[1]。健康對照組均來自本院健康體檢中心。ITP組：ITP患者64例，男22例，女42例，年齡15～78歲，血小板(2～30)×109/L。健康對照組：健康體檢者42例，男20例，女22例，年齡18～65歲，血小板(100～300)×109/L，組間年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 儀器與試劑 前列環(huán)素應(yīng)用液、乙腈、復(fù)方枸櫞酸鈉(ACD)液、芥子酸(SPA)、三羥甲基氨基甲烷(tris-HCl)緩沖液、3-環(huán)乙胺-l-丙磺酸3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、磷酸鹽緩沖液(×10)、高效液相色譜液(HPLC H2O)等均購自美國Sigma公司。蛋白質(zhì)芯片時間質(zhì)譜分析儀(PBSⅡ/C)、Au蛋白芯片由美國Ciphergen公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集與制備 抽取清晨空腹靜脈血2～3 mL,置于枸櫞酸抗凝管內(nèi)，立即加入前列環(huán)素應(yīng)用液(Sigma-Aldrich公司，美國)2～3 μL，放平顛倒混勻，動作要輕柔。離心15 min，用移液管將上層富血小板血漿(PRP)置于新試管內(nèi)，加2～3 μL前列環(huán)素應(yīng)用液?；靹蚝?，離心20 min,棄上層血漿(注意不要吸到貼壁的蛋白)，加入(ACD)液(Sigma-Aldrich公司，美國)0.5 mL，使血小板重懸。離心20 min，棄上清，加入0.1 mL去離子水。在-80與37 ℃之間反復(fù)快速凍融5次，離心20 min。獲得的上清液即為血小板裂解液,每30 μL分裝一管，每個樣本分裝3管，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｋ胁僮骶诘蜏叵逻M行，分裝時不能吸入下層的細(xì)胞，發(fā)生溶血的樣本應(yīng)舍棄。

1.3.2 上樣及質(zhì)譜檢測 將血小板裂解液置于冰盒表面融化后，取5 μL裂解液、5 μL SPA于新離心管(0.2 mL)底，將血小板裂解液與SPA混合后點樣，每個點加2 μL，晾干；待芯片表面晾干后，點加1 μL加能量吸收分子(EAM)，室溫晾干約15 min，重復(fù)點加1 μL，晾干后，每孔加入200 μL結(jié)合緩沖液，室溫振蕩洗滌3次，每次5 min，甩掉緩沖液，拍干后再加入200 μL HPLC液，洗脫2次，快速傾去，拍干。晾干后點加l μL SPA，10 min后重復(fù)一次，晾干后即可上機測量。采用PBSⅡ/C型蛋白質(zhì)指紋圖譜儀對結(jié)合蛋白質(zhì)的金芯片進行檢測，Ciphergen Proteinehip軟件自動采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.4 采集數(shù)據(jù) 用已知相對分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)芯片All-in-one(peptide or protein)(塞弗吉公司，美國)將獲得的蛋白質(zhì)分子量誤差校正到小于0.01，作好內(nèi)標(biāo)。根據(jù)P值小、均值差異大、標(biāo)準(zhǔn)差小的原則，采用Biomarker Wizard 3.1軟件篩選出差異蛋白。結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，以32例ITP患者和21例健康者訓(xùn)練組建立診斷模型，診斷模型采用輸入層含5個神經(jīng)元，隱含層含5個神經(jīng)元和輸出層含1個神經(jīng)元。設(shè)定訓(xùn)練組ITP患者的輸出值為1，健康者的輸出值為0，以0.5為界。學(xué)習(xí)率為0.01，訓(xùn)練1 000次，建立并儲存ANN診斷模型。采用驗證組盲法檢測診斷模型，進行模擬仿真計算，得出模型的診斷效能。

2 結(jié) 果

表1 ITP組和健康對照組差異蛋白質(zhì)的平均值、 標(biāo)準(zhǔn)差及P值比較

注：按質(zhì)荷比的P值升序排列。

2.2 診斷模型的建立和效能評價 將訓(xùn)練組(包含32例ITP患者、21例健康者)的上述4個蛋白質(zhì)峰強度輸入BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，建立ITP診斷模型。輸入層有4個神經(jīng)元，隱含層有5個神經(jīng)元，輸出層有1個神經(jīng)元。輸出值越接近1，診斷ITP的可能性越大，以0.5為界。此模型的學(xué)習(xí)率設(shè)為0.01，學(xué)習(xí)次數(shù)為1 000次。用驗證組(包括另32例ITP和21例健康者)進行盲法測試，結(jié)果顯示，32例ITP樣本有4例誤判，21例健康者有2例誤判。該模型診斷ITP的靈敏度93.3%，特異度82.6%，陽性預(yù)測值87.5%，陰性預(yù)測值82.6%。見表2。

表2 診斷模型1效率分析(n)

2.3 差異蛋白的初步鑒定 根據(jù)獲得差異蛋白質(zhì)質(zhì)荷比，在SWISS Prot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中查詢相對應(yīng)的蛋白質(zhì)。網(wǎng)址為：http://web.expasy.org/tagident/，查詢結(jié)果如下：m/z 3 543的蛋白質(zhì)對應(yīng)為神經(jīng)肽W-30，m/z 7 681對應(yīng)的為血小板第4因子，m/z 5 322對應(yīng)的為β-防御素，m/z 7 894對應(yīng)的為促性腺釋放素前體。

3 討 論

ITP是最常見的出血性疾病之一，以皮膚黏膜、內(nèi)臟出血較常見。目前，ITP的發(fā)病機制不明，大多數(shù)研究表明免疫機制在ITP的發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用[2]。血小板自身抗體導(dǎo)致血小板破壞增加,也可抑制骨髓巨核細(xì)胞，使其數(shù)量減少、形態(tài)變化、成熟障礙，導(dǎo)致血小板更新減少，無效血小板生成[3]。有報道稱血小板自身抗體不僅破壞血小板，還可引起血小板功能障礙。

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究越來越受到重視。蛋白質(zhì)組是指細(xì)胞、組織或器官的基因組所表達的全部蛋白質(zhì)[4]。作為生命活動的執(zhí)行者，蛋白質(zhì)表達水平的高低與疾病發(fā)展、轉(zhuǎn)歸、藥物作用或毒素作用直接相關(guān)。疾病的發(fā)生引起蛋白質(zhì)的改變，研究蛋白質(zhì)可為獲得疾病的特征提供線索。SELDI-TOF-MS技術(shù)結(jié)合蛋白組學(xué)最早用于惡性腫瘤生物標(biāo)志物篩選，廣泛應(yīng)用于卵巢癌、肝癌、乳腺癌等多種疾病，對篩選和鑒定腫瘤特異性標(biāo)志物提供有力工具，是研究蛋白質(zhì)組學(xué)的理想平臺[5]。Craddock等[6]應(yīng)用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)α-防御素是精神分裂癥易感性標(biāo)志物。Rolland[7]應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)檢測非霍奇金淋巴瘤不同亞型，獲得3個有意義的差異蛋白質(zhì)，經(jīng)免疫組化鑒定其中有兩個蛋白質(zhì)分別為組蛋白H4和H2B，具有促進細(xì)胞增殖的作用，可以將套細(xì)胞淋巴瘤與小淋巴細(xì)胞淋巴瘤、邊緣區(qū)淋巴瘤區(qū)分開。Tumblin[8]對鐮狀紅細(xì)胞貧血的血漿蛋白質(zhì)進行研究，質(zhì)荷比為28.1×103、11.7×103為顯著差異蛋白質(zhì)，經(jīng)免疫測定法證實分別為載脂蛋白A1、血清淀粉樣蛋白A，因此，臨床上可以通過檢測這2個蛋白質(zhì)來預(yù)測患者的急性疼痛發(fā)作期。

本實驗采用SELDI-TOF-MS技術(shù)直接對血小板裂解液進行研究，采用差異蛋白組學(xué)方法，獲得4個差異蛋白。m/z 3 543的蛋白質(zhì)對應(yīng)為神經(jīng)肽W-30，腦垂體腺苷環(huán)化酶激活肽(PACAP)和血管活性腸通過肽負(fù)調(diào)控使巨核細(xì)胞和血小板生成受損[9-10]。m/z 7 681對應(yīng)的為血小板第4因子，P?tschke等[11]認(rèn)為在心肺旁路術(shù)后第6天易產(chǎn)生抗血小板因子4/肝素復(fù)合物IgG抗體，這些抗體是有免疫介導(dǎo)的藥物不良反應(yīng)，肝素介導(dǎo)的血小板減少癥。m/z 5 322對應(yīng)的為β-防御素，García等[12]采用蛋白質(zhì)點陣法發(fā)現(xiàn)10個生物標(biāo)志物，通過多變量邏輯回歸分析，其中β-防御素2和白細(xì)胞介素-4受體(IL-4R)可以作為急性缺血性腦卒中惡化的獨立的危險因素。m/z 7 894對應(yīng)的為促性腺釋放素前體。Pazaitou等[13]認(rèn)為促性腺釋放激素和神經(jīng)肽受體在乳腺癌中表達提示預(yù)后不良。

本研究的優(yōu)點在于能夠從小樣本量中同時檢測大量的蛋白質(zhì)，從蛋白質(zhì)的整體水平研究機體的復(fù)雜變化，是其他檢測技術(shù)不能替代的。這個診斷模型的診斷效能高，比單一的蛋白質(zhì)峰更具說服力，靈敏度和特異度均比傳統(tǒng)的單一診斷方法較理想，為ITP的診斷提供了另一種參考。缺點主要是實驗樣本量較小，診斷模型還需要擴大樣本量進一步驗證。雖然盡量做到操作均衡，但是研究中仍然存在許多不可控因素，樣本中血小板計數(shù)較少，盡可能多的從中提取血小板單一成分的技術(shù)還有待進一步提高。對于SELDI-TOF-MS技術(shù)來說，每個質(zhì)荷比對應(yīng)的可能是很多相對分子質(zhì)量相近的多肽，不能明確C末端、N末端的序列，無法鑒定蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和生物學(xué)特性，下一步的工作將篩選出的差異蛋白質(zhì)提純，PCR基因檢測，鑒定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能研究。將診斷模型中的蛋白質(zhì)純化后制備成探針或試劑盒，可以臨床推廣應(yīng)用。

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Study of clinical study of platelet lysate differential protein in diagnosis of primary immune thrombocytopenia*

WUPeng-qiang,TANGJi-rui,HANLi-ying△

(DepartmentofHematology,AffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To establish a quick and simple diagnostic laboratory method with high sensitivity and good specificity for the diagnosis of primary immune thrombocytopenia ITP by studying platelet lysate differential protein in the patients with ITP for understanding its relationship with the onset of ITP.Methods The platelet lysate was detected in 64 cases of ITP and 42 cases of healthy people by surface enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry(SELDI-TOF-MS) technology for obtaining the platelet protein mass spectrum.The differential protein was screened and combined with the artificial neural network(ANN) for establishing the diagnostic model of ITP.Results The protein with the mass electron ratio(m/z) of 3 549.17 and 7 678.09 was highly expressed in the ITP group and which of m/z 5 328.29 and 7 894.32 was lowly expressed.The sensitivity and specificity of the diagnostic model were 93.3% and 82.6% respectively.Conclusion The established ANN model on the basis of platelet protein mass spectrum may have some clinical value for the diagnosis of ITP.

primary immune thrombocytopenia； proteomics； SELDI-TOF-MS

瀘州醫(yī)學(xué)院青年基金項目(12065)。

吳鵬強，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事血液系統(tǒng)疾病方面的研究?！?/p>

，E-mail:LYHLY@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.16.019

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1672-9455(2015)16-2346-03

2015-03-05

2015-04-15)