血清胸苷激酶1在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療中的應(yīng)用*

徐文鑫，梅序橋，劉慧麗(.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，福建漳州 363000；.福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市 醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建漳州 363000)

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·論 著·

血清胸苷激酶1在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療中的應(yīng)用*

徐文鑫1，梅序橋2，劉慧麗1(1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，福建漳州 363000；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市 醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建漳州 363000)

目的 探討血清胸苷激酶1(sTK1)在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病臨床診療中的應(yīng)用。方法 采用免疫印跡增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測39例急性淋巴細(xì)胞白血病兒童患者化療前、化療后的sTK1濃度及30例同期健康體檢兒童的sTK1濃度。結(jié)果 患兒組化療前的sTK1濃度明顯高于化療后完全緩解組、部分緩解組及對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；化療后不同療效組(完全緩解組、部分緩解組、未緩解組)之間sTK1濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；未緩解組與化療前的sTK1濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；化療前sTK1陽性檢出率明顯高于化療后及對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 sTK1的檢測對于兒童急性淋巴細(xì)胞白血病的篩查、輔助診斷、化療效果的評估具有重要參考價值。

血清胸苷激酶1； 兒童急性淋巴細(xì)胞白血??； 免疫印跡增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法

急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)在兒童白血病中發(fā)病率最高，有研究報道其占整個兒童白血病的75%以上，嚴(yán)重威脅著兒童健康[1]。臨床上,對于兒童ALL的診斷及化療療效觀察,依賴于骨髓穿刺、細(xì)胞病理檢查等手段。減少骨髓穿刺和細(xì)胞病理檢查次數(shù)，尋找其他輔助檢查指標(biāo)對疾病進(jìn)行初篩、輔助診斷、療效觀察，成為很多學(xué)者研究探索的方向。胸苷激酶(TK)是參與DNA補(bǔ)救合成途徑的關(guān)鍵酶，細(xì)胞質(zhì)胸苷激酶(TK1)是TK的一種同工酶，是一種細(xì)胞周期依賴性標(biāo)志物，是與細(xì)胞的DNA合成和細(xì)胞增殖密切相關(guān)的關(guān)鍵酶[2]。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，DNA復(fù)制循環(huán)加速,大量腫瘤細(xì)胞在S/G2期死亡，高濃度的TK1釋放到外周血，所以TK1在惡性腫瘤細(xì)胞和惡性腫瘤患者血液中升高。本研究利用免疫印跡增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測30例健康兒童和39例ALL患兒化療前及化療后sTK1濃度變化，探討sTK1在兒童急性淋巴細(xì)胞性白血病臨床診斷中的價值及療效評估中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院兒科2012年4月至2014年2月經(jīng)骨髓形態(tài)學(xué)、病理細(xì)胞學(xué)以及流式細(xì)胞術(shù)免疫學(xué)分型等檢查確診的ALL患兒39例，年齡1～10歲，平均(5.7±1.1)歲;另取本院同期健康體檢兒童30例作為對照組，年齡1～12歲，平均(5.2±2.7)歲?；?個療程后，根據(jù)治療結(jié)果將患兒組分為完全緩解組、部分緩解組及未緩解組，以各組研究對象的空腹血清作為檢測標(biāo)本，標(biāo)本采取時間分別為患兒組初次化療前及化療1個療程后，健康對照組標(biāo)本采取時間為體檢時?；純篈LL的診療標(biāo)準(zhǔn)均按照2006年中華醫(yī)學(xué)會兒科學(xué)分會血液學(xué)組制定的兒童ALL診療建議進(jìn)行。上述所有研究對象均排除其他腫瘤性疾病、傳染性疾病以及炎性疾病。

1.2 儀器與試劑 試驗(yàn)所使用的主要儀器為化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像分析儀，試劑是sTK1診斷試劑，均購自華瑞同康生物技術(shù)(深圳)有限公司。根據(jù)試劑盒說明書，以2 pmol/L 作為sTK1的水平臨界值，sTK1>2 pmol/L 即為檢出陽性。

1.3 方法 采用真空干燥管抽取空腹靜脈血3～5 mL，在2 h內(nèi)以3 000 r/min離心15 min，分離血清，將血清分裝于干燥離心管內(nèi)，保存于-20 ℃?zhèn)錂z。標(biāo)本收集完后，以試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品為參照，在標(biāo)準(zhǔn)曲線r≥0.95的情況下進(jìn)行測定,嚴(yán)格參照試劑盒提供的操作說明進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 各組sTK1濃度比較 患兒組化療前的sTK1值明顯高于化療后的完全緩解組、部分緩解組及對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；完全緩解組與部分緩解組及未緩解組的sTK1水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；未緩解組sTK1水平也明顯高于部分緩解組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；未緩解組與化療前組的sTK1水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組sTK1 濃度比較

注：與完全緩解組、部分緩解組、對照組比較，*P<0.01；與部分緩解組、未緩解組比較，**P<0.01；與未緩解組比較，***P<0.01；與化療前組比較，#P>0.05。

2.2 化療前、化療后及對照組血清sTK1陽性檢出率 患兒組化療前陽性率明顯高于化療后及對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；患兒組化療后陽性率也明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 患兒組與對照組sTK1 陽性檢出情況比較

3 討 論

白血病是常見的血液惡性腫瘤，我國每年有2萬例左右兒童白血病發(fā)生,在兒童白血病發(fā)病率中又以ALL為主。ALL是一種異質(zhì)性疾病，表現(xiàn)為原幼淋巴細(xì)胞在造血組織中惡性增殖和克隆。近年來，隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)的發(fā)展，人類深入了解了兒童ALL病因和發(fā)病機(jī)制,在診斷、治療上得到了長足的進(jìn)步，使得大多數(shù)ALL患兒經(jīng)化療后都能得到緩解。近年兒童ALL的無病生存率(EFS)已達(dá)80%以上。但在臨床上,對于兒童ALL的診斷、化療療效觀察及預(yù)后監(jiān)測,目前還是缺乏可靠的血清學(xué)檢測指標(biāo)，仍依賴于骨髓形態(tài)學(xué)、細(xì)胞病理檢查最終確定。骨髓穿刺是一種具有創(chuàng)傷性的標(biāo)本采集手段，對患兒的身心造成一定的影響，特別是對兒童本身及其家屬帶來很大的心理生理負(fù)擔(dān)。是否有一種血清學(xué)檢測指標(biāo)能對兒童ALL進(jìn)行初篩、輔助診斷、療效觀察及預(yù)后監(jiān)測，減少骨髓穿刺進(jìn)行細(xì)胞病理檢查次數(shù)，成為目前不斷研究探索的方向。

TK是調(diào)控DNA合成的關(guān)鍵酶之一，在ATP為供體及鎂離子(Mg2+)參與的條件下，催化胸苷磷酸(Thd)為胸苷一磷酸(TMP)，是胸腺嘧啶核苷進(jìn)入DNA代謝，參與合成DNA的唯一途徑。TK的兩種同工酶分別為TK1和線粒體胸苷激酶(TK2)，TK1主要存在于細(xì)胞質(zhì)中[3]。TK1是細(xì)胞周期依賴性標(biāo)志物，在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平與細(xì)胞周期有關(guān)，細(xì)胞分裂G1期含量比較低，在G1期到S期交界處逐漸升高，至S期達(dá)到最高，其高水平持續(xù)在S期到G2期，至M期才開始降解[4]。腫瘤細(xì)胞的增殖不同于正常細(xì)胞,其增殖不受凋亡調(diào)控,DNA復(fù)制循環(huán)加速,當(dāng)組織中S期細(xì)胞比例升高,大量腫瘤細(xì)胞在S/G2期死亡，高濃度的TK1釋放到外周血，引起體內(nèi)TK1升高。正常細(xì)胞在G1期死亡，此時細(xì)胞中TK1濃度很低，釋放到外周血的TK1濃度極微[5]。TK1是一種新興的腫瘤細(xì)胞增殖標(biāo)志物，大量研究表明，血清sTK1濃度檢測在鼻咽癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌、肝癌等實(shí)體癌癥的輔助診斷、療效評估、病情監(jiān)測及預(yù)后判斷都具有臨床意義[6-8]。但對TK1在血液腫瘤的治療評估中應(yīng)用研究最早的是TK1活性檢測。Gronowitz等[9]通過大量臨床試驗(yàn)證明TK1活性不僅可用于血液腫瘤的早期診斷，并可提示化療療效及預(yù)測疾病預(yù)后，與已知的腫瘤特異性標(biāo)志物結(jié)合提高診斷敏感性方面也有很大價值。徐衛(wèi)等[10]發(fā)現(xiàn)ALL患者sTK1表達(dá)水平與ALL其他預(yù)后因素相關(guān),在ALL的預(yù)后中具有重要價值。TK1活性檢測主要采用放射免疫法,由于放免法存在放射性污染，技術(shù)要求比較高，難于在臨床上推廣。He等[11]采用免疫印跡增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測sTK1濃度，發(fā)現(xiàn)sTK1濃度對于白血病化療效果的評估及臨床化療方案的調(diào)整也具有重要的臨床意義。曾智杰等[12]研究表明sTK1的濃度可用于血液腫瘤化療效果的評估,以及指導(dǎo)臨床進(jìn)行化療方案的調(diào)整。sTK1濃度檢測在血液病臨床診治中的價值也得到重視，但目前相對研究還是較少。

本研究以兒童ALL患兒為研究對象，并以健康體檢兒童作為對照組，對患兒組化療前及化療后(完全緩解組、部分緩解組、未緩解組)血清和對照組血清進(jìn)行sTK1濃度檢測，對各組的sTK1濃度及陽性率進(jìn)行比較。試驗(yàn)結(jié)果顯示，患兒組化療前sTK1濃度為(4.00±1.39)pmol/L，陽性率為87.1%；對照組sTK1濃度為(0.67±0.43)pmol/L，陽性率為3.4%，患兒組化療前的sTK1濃度及陽性率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，說明了ALL患兒骨髓造血干細(xì)胞的惡性增殖，白血病細(xì)胞在骨髓和其他造血組織中大量增生，白血病細(xì)胞中的TK1大量釋放進(jìn)入血液中，導(dǎo)致血液中TK1濃度升高。提示sTK1可作為兒童ALL的篩查、輔助診斷的血清學(xué)標(biāo)志物。

本研究同時對化療1個療程后的39例研究對象根據(jù)療效結(jié)果分為完全緩解組(19例)、部分緩解組(14例)、未緩解組(6例)，完全緩解組的sTK1濃度為(1.05±0.31)pmol/L，部分緩解組的sTK1濃度為(1.78±0.39)pmol/L，未緩解組的sTK1濃度為(3.56±0.64)pmol/L，3組間兩兩比較，sTK1水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，同時化療前sTK1濃度也明顯高于完全緩解組及部分緩解組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但化療前sTK1濃度與未緩解組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這提示著兒童ALL在有效的化療之后，完全緩解及部分緩解的患兒骨髓中造血干細(xì)胞異常增殖被不同程度地有效抑制，白血病細(xì)胞在造血組織中大量減少，血液中sTK1濃度降低，在骨髓細(xì)胞病理學(xué)的療效判斷標(biāo)準(zhǔn)中，完全緩解患兒骨髓中的原幼淋巴細(xì)胞降至5%以下，部分緩解組的患兒骨髓內(nèi)的原幼淋巴細(xì)胞降至5%至20%，可以發(fā)現(xiàn)sTK1濃度結(jié)果與ALL療效判斷標(biāo)準(zhǔn)中骨髓細(xì)胞病理學(xué)檢查結(jié)果是相符的。從sTK1檢出陽性率結(jié)果也顯示，化療后的陽性率(20.5%)與化療前的陽性率(87.1%)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。綜上所述，sTK1濃度對于兒童ALL的療效監(jiān)測及指導(dǎo)治療方案的調(diào)整具有重要意義。

本研究初步表明，sTK1濃度作為兒童ALL的初篩、輔助診斷具有一定的參考價值，并在兒童化療療效評估上也具有重要臨床意義。但本研究病例有限，缺少良性疾病的對照，研究結(jié)論有一定局限性，今后應(yīng)通過增加病例及良性病種的深入研究，探討sTK1在臨床上的價值。

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Application of serum thymidine kinase 1 in diagnosis and treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia*

XUWen-xin1,MEIXu-qiao2,LIUHui-li1

(1.ZhangzhouHealthVocationalCollege,Zhangzhou,Fujian363000,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedZhangzhouMunicipalHospitalofFujianMedicalUniversity,Zhangzhou,Fujian363000,China)

Objective To study the clinical application of serum thymidine kinase 1 (sTK1) in the diagnosis and treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia.Methods The Western blot-enhanced chemiluminescence assay was adopted to detect serum TK1 level in 39 cases of childhood acute lymphoblastic leukemia patients before and after chemotherapy and contemporaneous 30 healthy children.Results The sTK1 level before chemotherapy in the patients group was higher than that in the complete remission group and the partial remission group after chemotherapy,and the healthy control group,the differences were statistically significant(P<0.01);the sTK1 level had statistical differences among different curative effect groups after chemotherapy(complete remission group,partial remission group and non-remission group) (P<0.01);the sTK1 level had no statistical difference between the non-remission group and before chemotherapy (P>0.05);the positive detection rate of sTK1 before chemotherapy was significantly higher than that after chemotherapy and the healthy control group(P<0.01).Conclusion The sTK1 detection has the important reference value for screening,assisted diagnosis and evaluation of chemotherapeutic effect in childhood acute lymphoblastic leukemia.

serum thymidine kinase 1； childhood acute lymphoblastic leukemia； western blot-enhanced chemiluminescence assay

福建省教育廳科技項目(JB12320)。

徐文鑫，男，講師，本科，主要從事臨床實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)教學(xué)工作。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.16.006

A

1672-9455(2015)16-2311-03

2015-02-28

2015-05-20)