北京白羽鵪鶉微衛(wèi)星多態(tài)性分析

龐有志， 白俊艷， 張小輝， 趙淑娟， 吳勝軍， 于美琴， 許華偉

(河南科技大學動物科技學院，河南 洛陽 471003)

微衛(wèi)星(Microsatellite)又稱簡單重復序列，是一種以2～6 bp核苷酸為基本單位，呈串聯(lián)重復隨機分布于原核和真核生物基因組中的高度重復序列［1-4］。微衛(wèi)星標記具有多態(tài)性豐富且在基因組中分布均勻、檢測方便和共顯性遺傳等優(yōu)點。在鵪鶉遺傳育種方面微衛(wèi)星標記主要應用于遺傳圖譜的構建［5］、鵪鶉功能基因和 QTL 定位［6］、遺傳多樣性分析［7］等方面。北京白羽鵪鶉是朝鮮鵪鶉的一個突變系，是中國自行培育的高產蛋用品系，因其白羽性狀具有性連鎖遺傳的特點，該品系作為配套系的父本，與朝鮮鵪鶉、中國黃羽鵪鶉廣泛用于自別雌雄配套系生產［8］。本研究利用9對微衛(wèi)星標記對北京白羽鵪鶉群體進行多態(tài)性檢測，旨在為北京白羽鵪鶉的遺傳資源的評價、保護和利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 在河南科技大學試驗牧場，隨機抽取80只北京白羽鵪鶉，每只心臟采血2 ml，血樣采用檸檬酸葡萄糖(ACD)抗凝，血液∶ACD為6∶1(體積比)。－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 引物的選擇及合成 從國內外文獻上篩選多態(tài)性比較高且每個基因座至少有4個等位基因的微衛(wèi)星基因座，確定了9個微衛(wèi)星基因座作為本次研究的遺傳標記(表1)。引物序列送上海生工生物工程有限公司合成。

表1 9個微衛(wèi)星基因座的相關信息Table 1 Information for 9 microsatellite loci

1.2 方法

1.2.1 PCR反應條件 PCR反應體系總體積為12.50 μl，其中 ddH2O 8.65 μl，10 × Buffer 1.25 μl，Mg2+(25 mmol/L)0.75 μl，DNA 模板 0.50 μl，上、下游引物各0.50 μl(10 mmol/L)，dNTPs 0.25 μl，Taq酶0.10μl。PCR擴增反應程序:95℃預變性3 min;94℃變性45 s，根據表1的退火溫度退火60 s，72℃延伸60 s，30次循環(huán);最后72℃延伸12 min，4℃保存。

1.2.2 擴增產物的檢測及聚丙烯酰胺凝膠電泳 擴增產物用1.0×TBE電泳緩沖液配制成的1%瓊脂糖凝膠進行檢測。以DNA marker I作對照，在紫外透射分析儀上觀察，選擇特異性條帶明亮而且雜帶很少的樣品，進行8%非變性丙烯酰胺凝膠電泳檢測，120 V電泳2 h左右，硝酸銀染色后用成像儀拍照保存并分析。根據標準pBR322DNA/MspⅠMarker，檢測等位基因片段大小，確定各微衛(wèi)星基因座全部個體的基因型。

1.2.3 統(tǒng)計分析 通過分子生物學軟件POPGENE(Version1.32)分析每個基因座的多態(tài)信息含量(PIC)、有效等位基因數(shù)(Ne)、雜合度(H)。

2 結果

2.1 微衛(wèi)星基因座聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結果

9個微衛(wèi)星基因座在北京白羽鵪鶉群體中均具有明顯的多態(tài)性，其中微衛(wèi)星基因座GUJ0028和GUJ0029電泳圖結果見圖1、圖2。從圖1、圖2可以看出微衛(wèi)星基因座GUJ0028和GUJ0029具有豐富的多態(tài)性。

圖1 微衛(wèi)星基因座GUJ0028的PCR產物電泳圖Fig.1 Banding patterns of PCR product of GUJ0028 microsatelite

圖2 微衛(wèi)星基因座GUJ0029的PCR產物電泳圖Fig.2 Banding patterns of PCR product of GUJ0029 microsatelite

2.2 微衛(wèi)星等位基因數(shù)及基因頻率

9個微衛(wèi)星基因座在北京白羽鵪鶉群體中共檢測到43個等位基因，平均等位基因數(shù)為4.777 8(表2)。其中 GUJ0023、GUJ0029、GUJ0077均檢測到 6個等位基因，基因片段分別為 219～244 bp、147～175 bp、260 ～ 285 bp;GUJ0028、GUJ0057、GUJ0097均檢測到5個等位基因，基因片段分別為160～185 bp、147～170 bp、130～170 bp;GUJ083檢測到4個等位基因，基因片段為 130～155 bp;GUJ059和GUJ0063均檢測到3個等位基因，基因片段分別為240 ～246 bp、242 ～246 bp。

微衛(wèi)星位點 GUJ0023、GUJ0028、GUJ0029、GUJ0057、GUJ0059、GUJ0063、GUJ0077、GUJ0083 和GUJ0097在北京白羽鵪鶉群體中分別有15、12、15、13、9、4、14、9、17 種基因型。GUJ0023、GUJ0028、GUJ0029、GUJ0057、GUJ0059、GUJ0063、GUJ0077、GUJ0083和 GUJ0097優(yōu)勢基因分別為 240、170、175、160、246、244、280、147、155，優(yōu)勢基因型分別為242/238、185/170、175/160、162/162、246/246、244/244、280/280、147/147、155/155。

表2 9個微衛(wèi)星的等位基因大小和頻率Table 2 Allele size and frequencies of 9 microsatellite loci

2.3 微衛(wèi)星基因座的基因雜合度和多態(tài)信息含量

由表3可以看出，在北京白羽鵪鶉群體中微衛(wèi)星基因座GUJ0023多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)和雜合度均為最高，分別為0.751 9、4.659 8和0.785 4。9個微衛(wèi)星在北京白羽鵪鶉群體中平均多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)、雜合度分別為0.658 7、3.613 5、0.704 6。GUJ0023 和 GUJ0029 在白羽鵪鶉群體中的χ2值小于χ20.01，符合哈迪-溫伯格定律，其余均偏離哈迪-溫伯格平衡定律。

表3 9個微衛(wèi)星的等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)、雜合度Table 3 Number of alleles，polymorphism information content(PIC)，effective alleles and heterozygosity of 9 microsatelliate loci

3 討論

有效等位基因數(shù)是純合度的倒數(shù)，反映微衛(wèi)星位點上所有等位基因之間的相互影響程度。有效等位基因數(shù)越接近所檢測到的等位基因的絕對數(shù)，表明等位基因在群體中分布越均勻。本研究中9個微衛(wèi)星標記在北京白羽鵪鶉群體中有效等位基因數(shù)最小為2.103 0，最大達4.659 8，反映出9個微衛(wèi)星標記的等位基因在群體中分布不均勻。

多態(tài)信息含量(PIC)是衡量等位基因片段多態(tài)性的理想指標，當PIC≥0.50時表明該基因座為高度多態(tài)基因座，0.25≤PIC＜0.50時表明該基因座為中度多態(tài)基因座，PIC＜0.25時表明該基因座為低度多態(tài)基因座［9］。本研究中除了GUJ063(PIC=0.463 9)在北京白羽鵪鶉群體中為中度多態(tài)性基因座外，其余8個微衛(wèi)星基因座均為高度多態(tài)基因座，表明這8個微衛(wèi)星標記均可以作為北京白羽鵪鶉群體的有效遺傳標記進行遺傳多樣性分析。

遺傳雜合度表示在微衛(wèi)星基因座上雜合子個體占群體的比例，它反映微衛(wèi)星基因座在群體中的遺傳變異程度。雜合度越高，表明群體內遺傳多樣性就越高，遺傳變異程度就越大，反之則群體內遺傳變異程度就小。吳勝軍等［10］用同樣的9個微衛(wèi)星標記研究了朝鮮鵪鶉群體的遺傳多樣性，其平均雜合度為0.709 6，平均多態(tài)信息含量為0.663 9，而本研究中北京白羽鵪鶉的平均雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.704 6和0.658 7，可以看出北京白羽鵪鶉的變異程度略低于朝鮮鵪鶉，這可能與北京白羽鵪鶉所受到較高的選擇強度有關。北京白羽鵪鶉由朝鮮鵪鶉分化而來，培育至今已有20余年，比較兩者優(yōu)勢基因即可以看出兩群體分化的差異，在所研究的9個微衛(wèi)星基因座中，北京白羽鵪鶉在GUJ0023、GUJ0028、GUJ0029、GUJ0057、GUJ0059、GUJ0063、GUJ0077、GUJ0083和GUJ0097基因座優(yōu)勢基因分別為 240、170、175、160、246、244、280、147、155;而朝鮮鵪鶉除GUJ0063和GUJ0083兩個基因座與北京白羽鵪鶉具有相同的優(yōu)勢基因外，其他7個微衛(wèi)星基因座優(yōu)勢基因都發(fā)生了變化，這提示我們北京白羽鵪鶉從朝鮮鵪鶉分離純化后發(fā)生了一些群體變化，而且這種變化在Bai等［11］對朝鮮鵪鶉的另一種羽色突變系—中國黃羽鵪鶉的研究中也得到反映。另外，孟慶美等［12］報道了朝鮮鵪鶉群體中12個微衛(wèi)星的多態(tài)性，本研究檢測的9個微衛(wèi)星中有5個(GUJ0023、 GUJ0057、 GUJ0059、 GUJ0063 和GUJ0097)與其基因座相同，但檢測到的基因數(shù)不同，其中有 3個標記(GUJ0057、GUJ0063和GUJ0097)的等位基因數(shù)少于其研究結果，而另2個基因座等位基因數(shù)多于其研究結果。Farrag等［13］研究的13個微衛(wèi)星在3個日本鵪鶉品系中的平均雜合度為0.609 0，Hossein等［14］研究的12 個微衛(wèi)星在日本鵪鶉4個品系中的平均雜合度為0.434 3左右，而本研究的9個微衛(wèi)星在北京白羽鵪鶉群體中平均雜合度為0.704 6，表明北京白羽鵪鶉群體的遺傳變異程度明顯高于日本鵪鶉。

χ2檢驗結果表明，本研究測定的9個微衛(wèi)星基因座中除GUJ0023和GUJ0029外，其余7個基因座在北京白羽鵪鶉群體中均極顯著偏離遺傳平衡(P＜0.01)。遺傳平衡與否與檢測樣本數(shù)有一定關系，樣本不夠大時，有些基因座就可能檢測不到全部等位基因。Baker等［15］指出，在檢測每個品種時，為了避免出現(xiàn)誤差，樣本數(shù)應達到50個。就本研究而言，樣本數(shù)(80)已經達到抽樣要求，表明遺傳不平衡不是樣本的原因，很可能是北京白羽鵪鶉群體受到過度人工選擇或近親繁殖等因素的影響，這可能與近年來對北京白羽鵪鶉進行小群體保種有關。

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