棉花種質(zhì)種仁含油量測定及其遺傳多樣性分析

趙 君， 劉劍光， 吳巧娟， 趙 亮， 許劍文， 肖松華

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所/農(nóng)業(yè)部長江下游棉花油菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014)

棉花是中國重要的經(jīng)濟(jì)作物，在國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中具有舉足輕重的作用［1-3］。棉花不僅能夠提供重要的天然紡織原料，而且棉子中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、棉子糖、維生素等，棉仁中含有30.00%以上的脂肪，其中亞油酸含量高達(dá)55.60%，為加工高級保健油的原料，對預(yù)防和治療冠心病、動脈硬化、高血壓和高血脂等心腦血管疾病具有顯著療效［4］。然而，長期以來限制棉子高效利用的根本原因在于其中含有1%～2%棉酚及其衍生物。棉酚對人和單胃動物有毒害，食用后胃粘膜組織易被破壞，引起消化功能紊亂，因此棉子這種食物資源未能被充分開發(fā)利用［5］。隨著中國內(nèi)地棉花種植面積的不斷減少以及植棉經(jīng)濟(jì)效益的降低，棉花育種家越來越重視特種棉花品種的選育，其中低酚棉的種仁棉酚含量低于國家食用標(biāo)準(zhǔn)(＜0.02%)和國際食用標(biāo)準(zhǔn)(＜0.04%)，具有重要利用價值，所以選育低酚棉將是提高棉花綜合利用價值的一個重要方向。

棉子含油量是受多基因控制的數(shù)量性狀，而且不同研究者所采用的材料和方法不同，獲得的研究結(jié)果也存在差別，在不同的研究中主要存在上位性、加性和顯性效應(yīng)以及母體影響［6-8］。另外研究發(fā)現(xiàn)，棉子含油量也受環(huán)境的影響［9-10］。棉子油的主要成分是脂肪酸，而棉子中脂肪酸的代謝途徑受到多個酶的調(diào)節(jié)，其中檸檬酸合成酶和乙酰CoA羧化酶是2個最關(guān)鍵的限速酶。油酰卵磷脂基因(FAD2-1)是決定脂肪酸不同組分含量的關(guān)鍵酶。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性可以控制棉子蛋白質(zhì)和油脂的比例，預(yù)測通過調(diào)節(jié)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的表達(dá)改變棉子油分與蛋白質(zhì)比例，可以提高棉子中的脂肪酸含量，創(chuàng)造高含油量的棉花材料［11］。

為了提高棉花的綜合利用價值，育種目標(biāo)既要重視皮棉產(chǎn)量、纖維品質(zhì)、抗病性和抗蟲性的改良，又要兼顧棉子種仁含油量的提高。本研究以高含油量和低酚棉種質(zhì)系為試驗(yàn)材料，對32份棉花種質(zhì)系進(jìn)行遺傳多樣性分析，期望為高油、低酚棉花新品種選育奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用材料包含17個低酚棉品種(系)，其中9份由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供，分別是冀棉19、冀棉21、冀棉27、湘棉18號、遼棉11號、中棉所18、中棉所20、汾低99和海1，引入后嚴(yán)格自交繁殖保純;8份由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育，分別是蘇研 602、蘇研603、蘇研604、蘇研605、蘇研606、蘇研607、蘇研608和蘇研609，這些材料低酚性狀純合。12個種仁高含油量品種(系)，分別為荊55263、綿陽73-39、RNT78、紫色美棉、澳 siv-2、澳 C、澳L23、蘇聯(lián)棉91系、庫車T94-4、遠(yuǎn)93抗354、邯鄲長絨和M11。另外3個品種為蘇棉8號、陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1和泗抗1號，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所保存。

1.2 SSR 分析

取各品種(系)幼嫩葉片，DNA提取方法參照Paterson等［12］的CTAB法。根據(jù)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)公布的遺傳圖譜［13］均勻選取分布于棉花26條染色體上的370對SSR引物。所有引物信息可從http://www.genome.clemson.edu/projects/cotton 網(wǎng)站下載。分子標(biāo)記名稱中的大寫字母，如 BNL，JESPR等，代表引物的來源。Taq酶、dNTPs和PCR反應(yīng)的其他試劑均購自北京天為時代公司。PCR擴(kuò)增與染色參照張軍等［14］的方法。

1.3 棉花種仁含油量的測定以及脂肪酸組分分析

棉花種仁含油量測定采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 10359-1999測定方法。收取成熟期相近，成熟好的棉桃，經(jīng)濃硫酸脫絨。精選200粒飽滿種子，使用工具鉗將種殼夾出裂口，除去種殼后獲得種仁，利用研缽分別對每份種仁進(jìn)行充分研磨變成粉末狀。將濾紙放于105℃烘箱內(nèi)烘干2.5 h，置于干燥器內(nèi)冷卻至室溫，稱質(zhì)量(M1)。將1 g左右棉仁粉放入濾紙包內(nèi)，105℃烘箱內(nèi)烘干2.5 h，置于干燥器內(nèi)冷卻至室溫，稱質(zhì)量 (M2)。將稱質(zhì)量過后的裝有棉仁粉的紙包放入抽提管內(nèi)，使用無水乙醚浸泡16 h，再使用無水乙醚抽提8 h，控制抽提速度，保證1 h內(nèi)抽提6～8次。抽提后，取出紙包，靜止過夜，待殘留乙醚完全散發(fā)后，在105℃烘箱內(nèi)烘干2.5 h，稱質(zhì)量(M3)。棉仁含油量計(jì)算公式為:M=(M2－M3)/(M2－M1)×100%。每份樣品含油量數(shù)據(jù)均測定3次，取平均值，并保留兩位有效小數(shù)。

脂肪酸組成分析參考高建芹等［15］方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對凝膠上清晰可見且有差異的條帶進(jìn)行記錄，按分子量從大到小的順序計(jì)帶，有帶賦值為“1”，無帶賦值為“0”，將電泳圖譜數(shù)字化，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件NTSYSpc-2.10分析數(shù)據(jù)。利用非加權(quán)類平均法(Un-weighted pair group mathematics average，UPGMA)進(jìn)行聚類分析，并繪成樹狀圖。計(jì)算位點(diǎn)多態(tài)信息含量

2 結(jié)果與分析

2.1 種仁含油量及不同棉種脂肪酸含量分析

在本研究中，我們選擇了其中24個棉花品種(系)，測定了其種仁含油量和脂肪酸組分。結(jié)果顯示，24個品種(系)中包括常規(guī)陸地棉栽培品種(系)12個，分別是蘇研602、蘇研603、蘇研604、蘇研605、蘇研606、蘇研607、蘇研608、蘇研609、冀棉19、冀棉21、湘棉18號和泗抗1號，它們的含油量為28.26% ～32.14%，相互之間不存在顯著差異;但與其他12個高油品系相比，存在顯著差異。脂肪酸組分方差分析結(jié)果顯示，不同品種(系)之間脂肪酸組分存在顯著差異(表1)，但是在高含油量品種和低含油量品種之間沒有明顯差異，即脂肪酸不同組分的含量與含油量之間沒有顯著相關(guān)性(表2)。

表1 不同棉花品種(系)種仁含油量和脂肪酸組分Table 1 The oil content and percentage of fatty acids in different cotton varieties

根據(jù)脂肪酸組分測定結(jié)果，我們分析了不同品種間飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸的含量。其中，飽和脂肪酸包括肉豆蔻酸、棕櫚酸和硬脂酸;單不飽和脂肪酸包括棕櫚油酸、油酸和花生烯酸;多不飽和脂肪酸包括亞油酸和亞麻酸。結(jié)果顯示，飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的含量與含油量之間不存在顯著相關(guān)性。飽和脂肪酸含量變幅為24.00% ～28.20%，其中含量最高的是邯鄲長絨，最低的是湘棉18號。單不飽和脂肪酸含量變幅為15.12% ～20.52%，其中含量最高的是荊55263，最低的是蘇研604。多不飽和脂肪酸含量變幅為51.93% ～59.57%，其中含量最高的是蘇研602，最低的是邯鄲長絨(表3)。

表2 含油量與脂肪酸組分間的相關(guān)系數(shù)Table 2 Correlation coefficients between oil content and percentage of fatty acid

表3 不同棉花品種(系)間飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量Table 3 The contents of saturated and unsaturated fatty acids in cotton varieties

對24個品種(系)的含油量和脂肪酸組分的遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，在供試的24個品種(系)中，不同品種(系)的含油量和脂肪酸組分均呈正態(tài)或近似正態(tài)分布;脂肪酸組分中，肉豆蔻酸、硬脂酸和亞麻酸在不同品種(系)中分布比較集中，遺傳多樣性較差。棉花種仁含油量在不同品種之間差異很大，變 幅 為 28.26%～41.06%，變 異 系 數(shù) 為12.17%。其中含油量最高的是 M11，達(dá)到41.06%;最低的是蘇研606，含油量為28.26%。在供試的24個品種(系)中，棉花種仁脂肪酸組分在不同品種(系)之間存在非常大的差異，其中變異最大的是花生烯酸，變異系數(shù)達(dá)到20.30%;肉豆蔻酸含量變幅為0.61% ～0.92%，其中含量最高的是泗抗1號，最低的是澳 C;棕櫚酸含量變幅為20.90% ～24.67%，其中含量最高的是邯鄲長絨，最低的是湘棉18號;棕櫚油酸含量變幅為0.44%～0.59%，其中含量最高的是蘇聯(lián)棉91系，最低的是冀棉19;硬脂酸含量變幅為2.40% ～3.25%，其中含量最高的是泗抗1號，最低的是蘇研608;油酸含量變幅為14.15% ～19.66%，其中含量最高的是荊55263，最低的是蘇研 605;亞油酸含量變幅為51.66% ～59.26%，其中含量最高的是蘇研602，最低的是邯鄲長絨;亞麻酸含量變幅為 0.21%～0.40%，其中含量最高的是蘇研608，最低的是庫車T94-4;花生稀酸含量變幅為0.22% ～0.47%，其中含量最高的是湘棉18號，最低的是冀棉19(表4)。

表4 種仁含油量及脂肪酸組分的統(tǒng)計(jì)分析Table 4 Statistical analysis of oil content and percentage of fatty acid in 24 cotton varieties

2.2 SSR引物篩選及標(biāo)記信息分析

依據(jù)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)構(gòu)建的遺傳圖譜［13］，在各連鎖群每隔10 cM選取1個SSR標(biāo)記位點(diǎn)，共選用SSR標(biāo)記370對。對供試的32份材料進(jìn)行多態(tài)性初篩，其中190對引物擴(kuò)增穩(wěn)定，并表現(xiàn)出多態(tài)性，多態(tài)性比率為51.35%(表5)。

其中A亞組多態(tài)性位點(diǎn)百分率為59.16%，D亞組為43.46%。在190個多態(tài)性位點(diǎn)上共檢測到609個等位變異，各位點(diǎn)檢測到的等位變異數(shù)不同，變幅為2～9個，平均為3.09個;只檢測到2個等位變異的位點(diǎn)有78個，占總多態(tài)位點(diǎn)的41.05%;檢測到3個等位變異的位點(diǎn)50個，占26.31%;檢測到4個等位變異的位點(diǎn)33個，占17.37%;檢測到5個等位變異的位點(diǎn)17個，占8.95%;檢測到6個及6個以上等位變異的位點(diǎn)僅12個，占6.32%。檢測到2～3個等位變異的位點(diǎn)數(shù)占總位點(diǎn)數(shù)的67.38%，說明試驗(yàn)選擇的資源中等位變異數(shù)普遍較少，遺傳多樣性較低。190個位點(diǎn)多態(tài)信息含量(PIC)變幅為0.07～0.81，平均為0.40;多樣性指數(shù)變幅為0.15～0.83，平均為0.46;其中檢測到最多等位變異數(shù)的標(biāo)記是BNL3383，位于D9染色體，檢測到的等位變異數(shù)是9個，PIC值為0.81。A、D亞組分析結(jié)果顯示，A亞組平均等位變異數(shù)為3.25，多樣性指數(shù)為0.49;D亞組平均等位變異數(shù)為3.06，多樣性指數(shù)為0.47，說明陸地棉A亞組遺傳多樣性略高于D亞組。D亞組可能攜帶更多的控制重要育種目標(biāo)性狀的基因，在長期的品種改良中承受著更高的選擇壓力，從而造成更多、更強(qiáng)的選擇牽連效應(yīng)(表6)。

表5 基因組多態(tài)性標(biāo)記分布Table 5 Polymorphic marker distribution on 26 chromosomes of 32 cotton varieties

表6 190對SSR位點(diǎn)多態(tài)性信息統(tǒng)計(jì)Table 6 Information of 190 polymorphic SSR loci

2.3 遺傳多樣性和系譜分析

明確品種間親緣關(guān)系是育種中親本組配的前提。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件NTSYSpc-2.10分析32份材料的遺傳多樣性。利用非加權(quán)類平均法(Un-weighted pair group mathematics average，UPGMA)進(jìn)行聚類分析，并繪成樹狀圖(圖1)。32份材料被分成5個類群，在第一類群中包含本研究所有的19個陸地棉低含油量品種(系)，分別是蘇研系列品種(系)、冀棉19、冀棉21、冀棉27、遼棉11號、汾低99、泗抗1號、中棉所18、中棉所20、TM-1以及蘇棉8號。第二類群和第五類群只包含1個品種，分別是海1和紫色美棉。第三類群包含高含油量品種(系)綿陽73-39和荊55263。第四類群包含剩余的高油品種(系)，分別是 RNT78、澳 siv-2、澳 C、澳 L23、蘇聯(lián)棉91系、庫車 T94-4、遠(yuǎn)93抗354、邯鄲長絨和 M11。由分類結(jié)果可知，本研究所涉及的32個品種(系)中的高含油量品種(系)與低含油量品種(系)的遺傳差異比較大，遺傳距離遠(yuǎn)。高含油量品種(系)分布于3個類群，表明高含油量種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)比較豐富。

2.4 標(biāo)記與棉花種仁含油量的關(guān)聯(lián)分析

為減少群體結(jié)構(gòu)和個體間親緣關(guān)系對關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的影響，本研究分別利用TASSEL 2.1軟件［17］的一般線性模型(General linear model，GLM;Q)和混合線性模型(Mixed linear model，MLM;Q+K)程序，將196個位點(diǎn)的等位變異分別與種仁含油量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

與種仁含油量關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)見表7。采用一般線性模型檢測到與種仁含油量性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)11個，分布在9條染色體上，其中A亞組7個，D亞組4個;混合線性模型檢測到與種仁含油量性狀顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)9個，分布在7條染色體上，其中A亞組6個，D亞組3個，與標(biāo)記NAU2325和NAU5428連鎖的位點(diǎn)沒有檢測到。A12和D3染色體上檢測到2個位點(diǎn)，A12染色體上的位點(diǎn)分別是標(biāo)記BNL598和標(biāo)記NAU3294，D3染色體上的位點(diǎn)分別是標(biāo)記NAU2325和NAU4052。一般線性模型檢測到的位點(diǎn)解釋變異 0.056 0～0.144 9，其中達(dá)到極顯著水平的3個，分別是A12、D2和A2染色體上的標(biāo)記BNL598、CIR246和NAU5384;采用混合線性模型檢測到的位點(diǎn)解釋變異 0.043 6～0.132 3，其中達(dá)到極顯著水平的位點(diǎn)3個，與一般線性模型檢測到的極顯著位點(diǎn)相同(表7)。

圖1 32份材料的聚類分析圖Fig.1 Clustering analysis of 32 cotton germplasm

表7 與棉仁含油量性狀顯著相關(guān)的標(biāo)記位點(diǎn)及其對表型變異的解釋率Table 7 Marker loci associated with oil content trait and their explained phenotypic variations

3 討論

棉花是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，它不僅給人類提供了纖維原料，而且種子含有18% ～20%的油脂，棉花種仁直接榨油可生產(chǎn)高質(zhì)量的食用油，由于棉酚存在，極大地限制棉花種仁的利用。低酚棉種仁榨油無需精煉脫毒，可直接食用，所以選育顯性低酚高含油量棉花種質(zhì)對今后提高棉花整體利用價值具有重要意義［4］。本研究利用32份棉子材料其中包含17個低酚棉品種(系)和12份高油材料，測定其種仁含油量及脂肪酸組分，結(jié)果顯示，通過雜交選育的低酚棉品種(系)種仁含油量顯著低于高油材料，這與前人報道的含油量的遺傳偏向低油親本一致，即通過多代雜交選育，棉花種仁含油量將會不斷降低［18］。同時也有研究結(jié)果表明，棉花的母體效應(yīng)對子代含油量存在影響，其效應(yīng)要高于遺傳影響，這意味著在品種選育過程中選擇高含油量材料或低含油量材料做母本，對雜交后代種仁含油量將會有顯著影響［6，19］。

利用分子標(biāo)記研究不同棉花品種(系)的遺傳多樣性，分析其遺傳背景的差異，可以為今后通過配制棉花雜交組合選育高油低酚棉花種質(zhì)提供參考。本研究將32份材料通過聚類發(fā)現(xiàn)，低含油量品種(系)和高含油量品種(系)分為2大類，而且這2類群之間親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)。前人的研究結(jié)果表明，種仁含油量與棉花產(chǎn)量之間沒有相關(guān)性，與棉酚含量呈正相關(guān)［20-21］。說明在棉花產(chǎn)量及相關(guān)性狀的改善和提高時不會降低棉花種仁含油量。出現(xiàn)現(xiàn)有品種(系)的含油量顯著低于高油種質(zhì)的含油量的現(xiàn)象，主要有兩方面的原因:(一)棉花種仁含油量的遺傳模式可能會使雜交后代含油量降低;(二)棉花種仁含油量不是育種家在棉花品種選育過程中關(guān)注的主要指標(biāo)，導(dǎo)致現(xiàn)有品種(系)含油量的降低。

棉花種仁含油量是數(shù)量性狀，受多基因控制。Yu等［22］利用陸地棉與海島棉回交群體共檢測到17個與油份含量相關(guān)的QTLs，分布在12條染色體上，其中位于A12染色體上檢測到2個QTLs，其中1個解釋表型變異23.64%。劉小芳等［23］以陸地棉重組自交系群體為材料共檢測到8個與含油量相關(guān)的QTLs，其中位于D7染色體上的1個QTL在2個環(huán)境中能同時檢測到。李曉娜等以89份半野生棉為材料，應(yīng)用關(guān)聯(lián)分析，在3個年份環(huán)境下重復(fù)檢測出12個與棉仁含油量顯著相關(guān)的位點(diǎn)［24］。本研究檢測到的與含油量相關(guān)的位點(diǎn)與前人研究部分相同，這與研究材料不同有關(guān)系。另外本研究獲得的與已經(jīng)報道的不同的與棉仁含油量性狀顯著相關(guān)的標(biāo)記位點(diǎn)，可能為棉仁含油量性狀的分子標(biāo)記輔助選擇提供依據(jù)。

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