極端粒形水稻品種GS5基因的序列及效應(yīng)分析

鄭 佳， 丁 丹，2， 梁彥麗，2， 張亞東， 王才林

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心/國(guó)家水稻改良中心南京分中心，江蘇 南京210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

水稻是中國(guó)人賴以生存的重要糧食作物，提高水稻產(chǎn)量一直以來(lái)都是科研人員研究的重點(diǎn)之一，矮化育種和雜交育種這兩大歷史性的科學(xué)研究成果使水稻產(chǎn)量在上世紀(jì)得到了較大幅度的提高［1-3］。隨著分子生物學(xué)日新月異的發(fā)展，研究者們開始從分子生物學(xué)這一角度思考如何提高水稻產(chǎn)量。水稻的產(chǎn)量主要取決于每株水稻的穗數(shù)，每穗的谷粒數(shù)以及粒質(zhì)量，而粒質(zhì)量主要由粒型決定［4］。

目前利用分子生物學(xué)手段定位和克隆到一些與粒型密切相關(guān)的基因如 GW2［5］、qSW5［6］/GW5［7-8］、GS3［9-10］、GS5［11］、GW8［12］和 qGL3［13］/GL3.1［14］等。GS5 是控制水稻粒寬、粒質(zhì)量和充實(shí)度的主效QTL。Li等利用 zhenshan97和H94的雜交種構(gòu)建的單倍體加倍性群體發(fā)現(xiàn)位于第5條染色體短臂上的GS5基因。通過(guò)形態(tài)學(xué)比較不同等位基因構(gòu)成的近等基因系的水稻發(fā)現(xiàn)擁有大粒單倍型GS5基因的水稻幼穗的內(nèi)稃，外稃在橫切面上擁有更多的細(xì)胞數(shù)目。與野生型相比，過(guò)表達(dá)大粒型GS5基因的植株在細(xì)胞周期G1/S階段的一些相關(guān)基因表達(dá)量上調(diào)。這些證據(jù)證明GS5作為細(xì)胞周期基因的上游正調(diào)控因子，其高表達(dá)量可以通過(guò)調(diào)節(jié)有絲分裂行為來(lái)增加細(xì)胞數(shù)目，從而控制籽粒大小。通過(guò)分析GS5基因ORF區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)域的序列發(fā)現(xiàn)位于啟動(dòng)子區(qū)域的序列多態(tài)性是對(duì)粒形產(chǎn)生影響的原因，而非其編碼區(qū)［11］。

本研究以江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所雜交秈稻項(xiàng)目組選育獲得的1個(gè)新的特大粒粳稻材料TD70和小粒秈稻Kasalath為研究對(duì)象，對(duì)2個(gè)水稻品種的GS5基因的基因組序列和cDNA序列進(jìn)行克隆和分析，并設(shè)計(jì)1對(duì)SSR分子標(biāo)記，對(duì)2個(gè)親本及來(lái)源于這2個(gè)親本的240個(gè)重組自交系(RILs)群體的GS5基因型和表型進(jìn)行檢測(cè)，為明確粒型控制基因GS5在2種極端粒型水稻中的序列差異和作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

來(lái)源于天鵝谷///9520//(72-496/御糯)的特大粒粳稻TD70和小粒秈稻Kasalath，其粒寬2年平均分別為4.42 cm和2.55 cm;TD70/Kasalath的240個(gè)重組自交系(RILs)。用游標(biāo)卡尺(精確到0.01 mm)測(cè)量240個(gè)RILs及其親本的單個(gè)籽粒長(zhǎng)度。每個(gè)品種或株系隨機(jī)取5個(gè)單株，每株隨機(jī)選取10粒飽滿籽粒測(cè)定，取平均值作為粒寬的表型值。

1.2 植物DNA、RNA提取及cDNA合成

水稻DNA提取以新鮮葉片為材料，總RNA提取以生長(zhǎng)旺盛期的根、莖、幼穗的混合樣為材料，DNA、RNA提取試劑盒采用 OMEGA 公司的 Plant DNA Kit和 Plant RNA Kit，提取的RNA用DNa se I處理樣本，瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量后進(jìn)行第一鏈c DNA的合成。第一鏈cDNA合成試劑盒采用Fermentas公司RevertAid First Strand cDNA synthesis kit，膠回收采用 Axygen公司的膠回收試劑盒。

1.3 引物設(shè)計(jì)、合成與序列測(cè)定

特異性引物利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)，并由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成，序列測(cè)定由英濰捷基貿(mào)易有限公司完成。

1.4 GS5基因的DNA序列的克隆

以提取的TD70和Kasalath基因組為模版，特異性基因GS5G1F、GS5G1R、GS5G2F和GS5G2R擴(kuò)增引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分段擴(kuò)增GS5基因，測(cè)序結(jié)果利用DNAman進(jìn)行拼接后即為完整的GS5基因DNA序列。以提取的 TD70和 Kasalath的總RNA為模版，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后利用特異性擴(kuò)增引物GS5F、GS5R通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增GS5基因的cDNA全長(zhǎng)。

1.5 PCR產(chǎn)物的克隆、純化與篩選

PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，確定片段大小正確無(wú)誤后，切膠回收，純化。連接到pGEM-T克隆載體上，熱激法導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行氨芐抗性法和X-gal/IPTG藍(lán)白斑篩選，挑取陽(yáng)性菌落在含有氨芐的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR，擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán);72℃5 min。電泳后將檢測(cè)為陽(yáng)性的菌落送公司測(cè)序，約10個(gè)重復(fù)樣。

2 結(jié)果

2.1 GS5基因DNA、cDNA全長(zhǎng)克隆與序列分析

已知的GS5基因(Os05g0158500)序列長(zhǎng)4 466 bp，分段設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物 GS5G1F:5'-CTCCCATGGAATTACTAGAGAA-3'，GS5G1R:5'-TTGGACATGTTTACATCCACAT-3';GS5G2F: 5'-TGTATGGTCTAACATTCAGAATTC-3'，GS5G2R:5'-GCGCACTTGAAATTGATTTG-3'。利用 NCBI的 Primerblast檢測(cè)引物對(duì)在水稻中僅可以擴(kuò)出1個(gè)片段。利用引物對(duì)在TD70和Kasalath的全基因組中擴(kuò)增出的片段測(cè)序拼接后發(fā)現(xiàn)TD70品種中該片段TGS5g長(zhǎng)度為 4 449 bp，Kasalath品種中該片段KGS5g長(zhǎng) 度 為 4 441 bp，它 們 與 已 知 GS5(Os05g0158500)基因的序列相似性達(dá)99.82%。

利用已擴(kuò)增出的基因組序列結(jié)合NCBI上下載的已知GS5基因序列信息，設(shè)計(jì)cDNA擴(kuò)增引物GS5F: 5'-ATGGCGGTGGCGG-3'，GS5R: 5'-TCATCTGCTTGTCGGAAG-3'，在 TD70 和Kasalath反轉(zhuǎn)錄的cDNA模版上分別擴(kuò)增出1條約1 500 bp大小的片段。測(cè)序結(jié)果顯示，TD70品種中該片段TGS5長(zhǎng)度為1 449 bp，編碼482個(gè)氨基酸殘基，Kasalath品種中該片段KGS5長(zhǎng)度為1 443 bp，編碼480個(gè)氨基酸殘基，它們與已知 GS5(Os05g0158500)序列相似性達(dá)99.84%。TGS5和Os05g0158500的開放閱讀框在堿基的+92位是G，因此第31位編碼的氨基酸為甘氨酸;KGS5的開放閱讀框在堿基的+92位是C，該位點(diǎn)編碼的氨基酸為丙氨酸，且在+106～111 bp缺失GGCGGC6個(gè)堿基，即第36、37位編碼的氨基酸缺失2個(gè)甘氨酸(圖1)。

比較GS5基因的DNA序列和cDNA序列發(fā)現(xiàn)TGS5和KGS5基因在基因結(jié)構(gòu)上包含10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子(圖2)。

2.2 GS5基因分子標(biāo)記設(shè)計(jì)及驗(yàn)證

分析TD70和Kasalath的GS5基因序列上的多處差異，根據(jù)KGS5基因第一外顯子中GCGGCG的缺失設(shè)計(jì)SSR(Simple sequence repeats)標(biāo)記，正向引物GS5SSR-F:5'-AGGCGGCGAGATGTCTCTTGTC-3'，反 向 引 物 GS5SSR-R:5'-CTGCGCCTCGAAGAACCAGTAG-3'(圖3)。該引物在 TD70中可以擴(kuò)增出216 bp的條帶，在Kasalath中可以擴(kuò)增出210 bp的條帶(圖4)。

2.3 功能標(biāo)記對(duì)TD70/Kasalath RIL群體的鑒定

利用上述分子標(biāo)記檢測(cè)TD70與Kasalath為親本構(gòu)建的重組自交系群體的結(jié)果顯示，240個(gè)株系中含有GS5-T基因(表現(xiàn)TGS5基因型)的株系有122個(gè)，含有GS5-K(表現(xiàn)KGS5基因型)基因的株系有118個(gè)。含GS5-T基因的株系平均粒寬為 (3.26±0.37)mm，平均千粒質(zhì)量為 (32.61±7.66)g，含GS5-K基因的株系平均粒寬為 (2.98±0.28)mm，平均千粒質(zhì)量為 (29.74±6.36)g，兩者分別相差0.47 mm和2.87 g，粒寬存在極顯著差異(表1)，說(shuō)明GS5是水稻粒寬性狀的主效調(diào)控基因。此外，GS5對(duì)水稻的粒長(zhǎng)、粒厚都有一定的影響，具有多效調(diào)節(jié)作用。

2.4 GS5基因?qū)λ玖挼淖饔眉芭c已知其他基因的比較

GW2基因是控制水稻粒寬的主效基因，某些大粒型水稻品種中存在的功能缺失型是籽粒變寬的重要調(diào)節(jié)因素，我們之前的研究已經(jīng)證實(shí)本試驗(yàn)所用研究材料TD70品種擁有稀有的GW2功能缺失型，是TD70的超寬籽粒的正向調(diào)控因子［15］，且在TD70和 Kasalath構(gòu)建的重組自交系中，GW2對(duì)粒寬的貢獻(xiàn)較大，含GW2－T基因的株系平均粒寬比含GW2－K基因的株系平均粒寬分別高出0.47～0.51 mm，千粒質(zhì)量高出5.54～6.05 g［15］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)同一重組自交系群體中，含GS5－T基因的株系平均粒寬比含GS5－K基因的株系平均粒寬高出0.47 mm，千粒質(zhì)量高出2.87 g。說(shuō)明GS5對(duì)粒寬調(diào)控效應(yīng)與GW2相當(dāng)，但是對(duì)千粒質(zhì)量的調(diào)控效應(yīng)沒有GW2強(qiáng)。

圖1 TD70品種中GS5基因片段及預(yù)測(cè)編碼的氨基酸Fig.1 GS5 sequence fragment and encoded protein prediction in TD70

圖2 TGS5和KGS5的基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of TGS5 and KGS5 genes

圖3 TGS5和KGS5差異位點(diǎn)及引物序列所處的位置Fig.3 The polymorphic loci and primers locations of TGS5 and KGS5

圖4 GS5分子標(biāo)記對(duì)TD70、Kasalath和RIL群體中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification of GS5 with SSR marker in TD70，Kasalath and RILs

表1 含不同來(lái)源的GS5基因的株系的粒型表現(xiàn)Table 1 Grain phenotype of lines with different GS5 genotypes

3 討論

GS5是控制水稻粒寬、粒質(zhì)量和充實(shí)度的主效QTL。已有研究結(jié)果表明GS5基因啟動(dòng)子區(qū)域的序列多態(tài)性是影響水稻粒寬的原因，而非其編碼區(qū)［11］。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)極端粒型水稻TD70和Kasalath 2個(gè)品種的GS5基因的研究并未發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的啟動(dòng)子區(qū)域的差異，但是編碼區(qū)存在GGCGGC的插入缺失位點(diǎn)。寬粒TD70型的GS5基因較窄粒Kasalath型GS5基因所編碼的氨基酸序列中存在1個(gè)甘氨酸向丙氨酸的變化和2個(gè)丙氨酸的增加。本研究利用該差異位點(diǎn)成功設(shè)計(jì)區(qū)分2種類型GS5基因的SSR標(biāo)記，對(duì)重組自交系群體分型后發(fā)現(xiàn)TD70型的GS5基因?qū)λ玖捑哂酗@著的正調(diào)控作用，效應(yīng)與GW2相當(dāng)，對(duì)粒寬、粒厚和千粒質(zhì)量也有一定的正向調(diào)控效應(yīng)。在高粱、玉米等其他禾本科植物中也發(fā)現(xiàn)了水稻GS5基因的直系同源基因，有些物種內(nèi)還存在側(cè)向同源基因 ，說(shuō)明GS5基因?qū)ψ蚜５恼{(diào)控作用并不單一存在于水稻中。

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