水稻GLW7基因功能標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和基因效應(yīng)分析

梁文化 孫旭超 陳濤 岳紅亮 田錚 趙凌 趙慶勇 趙春芳 朱鎮(zhèn) 張亞?wèn)| 王才林

摘要：根據(jù)水稻粒長(zhǎng)和粒質(zhì)量調(diào)控基因GLW7已知功能位點(diǎn)的核苷酸差異設(shè)計(jì)分子標(biāo)記，并對(duì)國(guó)內(nèi)外搜集的315份秈、粳稻品種資源進(jìn)行基因型檢測(cè)，分析其不同基因型的分布。同時(shí)，通過(guò)粒型性狀的測(cè)定，分析該基因的遺傳效應(yīng)，評(píng)估其育種利用價(jià)值。結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的功能標(biāo)記能準(zhǔn)確、有效地區(qū)分出201 bp和190 bp 2種帶型，即大粒（Large grain haplotype，LGH）和小粒（Small grain haplotype，SGH）2種等位變異。從秈、粳亞種間的基因型分布來(lái)看，秈亞種中LGH和SGH的比例分別為95.65%和4.35%，而粳亞種中LGH和SGH比例分別為25.50%和74.50%，2種等位變異的分布在秈粳亞種間存在明顯差異。粒型的測(cè)定結(jié)果表明，含不同等位變異的品種在粒長(zhǎng)、粒厚、長(zhǎng)寬比和千粒質(zhì)量上存在顯著或極顯著差異，而粒寬則沒(méi)有明顯差異。進(jìn)一步通過(guò)秈、粳分類分析發(fā)現(xiàn)，亞種間2種等位變異對(duì)粒型的效應(yīng)并不完全一致，但都具有提高籽粒質(zhì)量的作用。

關(guān)鍵詞：水稻;粒型;GLW7基因;功能分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S511.032文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）02-0257-08

Abstract： In this study， molecular markers were designed according to the nucleotide differences of functional loci of GLW7 gene regulating rice grain length and grain weight. Genotypes of 315 indica and japonica varieties collected at home and abroad were detected， and the distribution of different genotypes was analyzed. Simultaneously， the genetic effects of the gene were analyzed， and its breeding value was evaluated by the determination of grain shape traits. The results showed that the designed functional markers could accurately and effectively distinguish 201 bp and 190 bp bands， which was corresponding to large grain haplotype （LGH） and small grain haplotype （SGH）， respectively. According to the genotype distribution between indica and japonica subspecies， the proportion of LGH and SGH in indica subspecies was 95.65% and 4.35%， while that was 25.50% and 74.50% in japonica subspecies， respectively. It was indicated that there was a significant difference in genotype distribution between two rice subspecies. The results of the grain size measurement showed that there were significant or extremely significant differences in grain length， grain thickness， length-width ratio and thousand grain weight among varieties with different allele variations， but there was no significant difference in grain width. Further analysis showed that the genetic effects of two allelic variations on grain shape were not identical between indica and japonica varieties， but the two allelic variations could increase grain weight.

Key words：rice;grain shape;GLW7 gene;functional molecular marker

水稻粒型包括粒長(zhǎng)、粒寬和粒厚3個(gè)基本要素，是影響產(chǎn)量和品質(zhì)的重要農(nóng)藝性狀[1-2]，因此粒型基因的發(fā)掘和利用備受重視。目前水稻中已經(jīng)定位了400多個(gè)與粒型相關(guān)的QTL，克隆的粒型基因已經(jīng)超過(guò)60個(gè)，其中控制粒長(zhǎng)的主要基因有GS3、GL3.1/qGL3、GLW7、OsLG3、TGW3、OsMADS1和GS9等[3-12]，控制粒寬的基因有GW2、GW5/qSW5、GS5、GW7和GW8等[13-18]，控制粒厚的基因有WTG1[19-20]。從對(duì)粒型的效應(yīng)看，GS3、qGL3、GW2、qSW5/GW5、GS9等基因?qū)αＰ途哂胸?fù)調(diào)控效應(yīng)，而GS5、GW8、GW7、GLW7、OsLG3、OsMADS1等基因則對(duì)粒型具有正調(diào)控作用。大量的研究結(jié)果證實(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)籽粒性狀可以增加千粒質(zhì)量，從而提高水稻產(chǎn)量。

GLW7基因編碼植物特異性轉(zhuǎn)錄因子OsSPL13，具有SPL家族特有的保守結(jié)構(gòu)，能調(diào)節(jié)多個(gè)重要的生物學(xué)進(jìn)程[8]。GLW7基因正調(diào)控粒長(zhǎng)、粒厚和粒質(zhì)量，而對(duì)粒寬沒(méi)有明顯的影響。在OsSPL13位點(diǎn)5′-UTR區(qū)域的一個(gè)6 bp的串聯(lián)重復(fù)序列CACTTC重復(fù)次數(shù)的變化是影響該基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的關(guān)鍵。Si等[8]通過(guò)對(duì)47個(gè)熱帶粳稻品種OsSPL13位點(diǎn)的測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)可分為2種不同的變異類型，即6個(gè)bp的CACTTC序列重復(fù)1次和2次兩種類型，而對(duì)部分秈稻品種進(jìn)行分析只檢測(cè)到該序列重復(fù)1次的等位型。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)大粒水稻的OsSPL13位點(diǎn)6 bp序列重復(fù)1次，而小粒水稻品種該序列重復(fù)2次，根據(jù)兩種基因型對(duì)應(yīng)的籽粒形態(tài)特征，分別用大粒型（LGH）和小粒型（SGH）表示。通過(guò)對(duì)基因堿基序列的進(jìn)化分析和1 040個(gè)水稻品種7號(hào)染色體遺傳差異的研究，推測(cè)熱帶粳稻中大粒等位型是秈稻品種漸滲而來(lái)的。通過(guò)對(duì)野生型和突變體的種子外稃長(zhǎng)軸方向上細(xì)胞數(shù)目和大小分析，發(fā)現(xiàn)GLW7是通過(guò)增加細(xì)胞體積而使籽粒變大的。進(jìn)一步研究證實(shí)GLW7能夠與DEP1基因互作，同時(shí)對(duì)穗長(zhǎng)、一次枝梗數(shù)目和二次枝梗數(shù)目產(chǎn)生顯著影響[8]。因此，GLW7基因可以顯著改善籽粒大小和穗粒結(jié)構(gòu)，在水稻育種中具有重要的利用價(jià)值。

分子標(biāo)記輔助選擇是作物育種中利用優(yōu)異基因的有效手段[21]，通過(guò)開(kāi)發(fā)粒型基因分子標(biāo)記能夠準(zhǔn)確、高效地鑒定調(diào)控作物籽粒大小的有利等位變異[22-25]。為加快GLW7基因有利等位變異在水稻育種中的利用，本研究根據(jù)GLW7基因已知功能位點(diǎn)的核苷酸差異設(shè)計(jì)分子標(biāo)記，并對(duì)國(guó)內(nèi)外搜集的315份秈、粳稻品種資源進(jìn)行基因型檢測(cè)，分析其不同基因型的分布，同時(shí)，通過(guò)粒型性狀的測(cè)定，分析該基因的遺傳效應(yīng)，評(píng)估其在育種中的利用價(jià)值。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為江蘇省種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)保存的315份國(guó)內(nèi)外秈、粳稻品種，其中秈稻115份，粳稻200份（表1）。上述材料于2017年種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田，5月10日播種，6月10日移栽，每個(gè)品種種植4行，每行10株，株距為13.5 cm，行距為16.5 cm，常規(guī)栽培和管理。

1.2水稻成熟種子粒型相關(guān)性狀數(shù)據(jù)的測(cè)定

成熟后，每個(gè)品種按單株收取5個(gè)植株的種子。每個(gè)單株隨機(jī)挑選10粒飽滿種子使用游標(biāo)卡尺（精度0.01 mm）測(cè)量粒長(zhǎng)、粒寬和粒厚，用電子天平（精度0.001 g）測(cè)定單株1 000粒風(fēng)干種子的質(zhì)量（千粒質(zhì)量）。每個(gè)性狀以5株的平均值為最終的表型值。

1.3GLW7基因功能標(biāo)記開(kāi)發(fā)和引物合成

根據(jù)Si等[8]的報(bào)道，從NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載到小粒品種Dongjing（DJ）和大粒品種GP7 GLW7的基因組序列LT159866.1和LT159955.1。通過(guò)多序列比對(duì)分析，選取變異位點(diǎn)上、下游200 bp的核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0 軟件對(duì)GLW7基因5′端非翻譯區(qū)（Untranslated region，UTR）中-146～-135 bp區(qū)域CCATTC串聯(lián)重復(fù)的變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，并由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.4DNA提取、PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)

在水稻分蘗盛期，取新鮮幼嫩的葉片，采用CTAB法提取水稻基因組DNA[26]，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。10 μl的PCR反應(yīng)總體系包含：ddH2O 7.2 μl，模板DNA（20 ng/μl）1.0 μl，10×Buffer（25.0 mmol/L）1.0 μl，dNTP（2.5 mmol/L）0.2 μl，正、反向引物（10 μmol/L）0.4 μl，Taq DNA聚合酶（2 U/μl）0.2 μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，57 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min，4 ℃保持2 min。引物擴(kuò)增產(chǎn)物在9%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，銀染后在膠片觀察燈上拍照、統(tǒng)計(jì)。

1.5數(shù)據(jù)分析

利用Excel（2016）和SPSS（22.0）軟件進(jìn)行粒型相關(guān)數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1GLW7基因的堿基序列分析及功能標(biāo)記開(kāi)發(fā)

從NCBI網(wǎng)站下載小粒品種Dongjing（DJ）和大粒品種GP7的基因組序列LT159866.1（5 864 bp）和LT159955.1（5 840 bp）進(jìn)行序列比對(duì)分析。結(jié)果表明，GLW7基因在大粒品種中5′-UTR區(qū)域-146～-135 bp CACTTC重復(fù)1次，而在小粒品種中重復(fù)2次，這與已報(bào)道的結(jié)果完全一致，而該短序列串聯(lián)重復(fù)次數(shù)差異是影響GLW7基因表達(dá)水平和籽粒大小的關(guān)鍵。5′-UTR區(qū)域的6 bp短序列重復(fù)1次，GLW7基因表達(dá)水平升高，正調(diào)控穎殼細(xì)胞體積而使籽粒變大;而該短序列重復(fù)2次則降低了基因的表達(dá)水平，使籽粒變小[8]。在其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（ATG）上游5′-UTR區(qū)域串聯(lián)重復(fù)序列變異的位點(diǎn)附近分別設(shè)計(jì)上游引物GLW7-F 5′-TATCCCTTTCAACCTTTTCCA-3′和下游引物GLW7-R 5′-GACGACGAGCTAGTGCTACTGT-3′。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)在功能位點(diǎn)附近大粒品種GP7還存在5 bp的缺失，因而最終PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的差異是由兩個(gè)鄰近位置的插入缺失（InDel）造成的，因而小粒品種Dongjing（DJ）能擴(kuò)增出201 bp的條帶，而大粒品種GP7則能擴(kuò)增出190 bp的條帶（圖1）。

2.2GLW7基因功能標(biāo)記驗(yàn)證

為驗(yàn)證功能標(biāo)記GLW7-F/GLW7-R在水稻品種中是否能進(jìn)行有效擴(kuò)增并區(qū)分GLW7基因的不同等位變異，從315份水稻資源中隨機(jī)選取秈、粳稻品種各40個(gè)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示每個(gè)品種都能擴(kuò)增出單一、清晰的條帶，沒(méi)有非特異性擴(kuò)增和拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明本研究設(shè)計(jì)的引物特異性較好，擴(kuò)增效率高。從帶型來(lái)看，所有秈、粳稻品種都能擴(kuò)增出與大、小粒品種GP7和Dongjing（DJ）同樣的190 bp或201 bp 2種類型的條型，分別代表GLW7基因功能變異區(qū)域6 bp短序列重復(fù)1次和2次的結(jié)果（圖2、圖3）。這表明，該功能標(biāo)記能夠準(zhǔn)確、有效地區(qū)分秈、粳稻品種中GLW7基因2種等位變異。

2.3GLW7基因功能標(biāo)記對(duì)不同水稻品種的基因型鑒定

為明確GLW7基因在秈、粳稻品種中的基因型分布以及對(duì)粒型的效應(yīng)。利用功能標(biāo)記GLW7-F/GLW7-R繼續(xù)對(duì)所有的115份秈稻和200份粳稻資源進(jìn)行基因型檢測(cè)。結(jié)果顯示大?；蛐秃托×；蛐偷钠贩N數(shù)分別為161份和154份;115份秈稻品種中大?；蛐?10份（95.65%），而200份粳稻品種中大?；蛐蛢H為51份（25.50%）。由此可見(jiàn)GLW7基因等位變異在秈稻和粳稻中的分布存在明顯差異（表1）。

為分析GLW7基因不同等位變異對(duì)粒型的影響，我們?cè)?017年對(duì)315份水稻品種資源進(jìn)行粒型相關(guān)性狀的測(cè)定。結(jié)果顯示，含GLW7大粒等位變異的品種在粒長(zhǎng)、粒厚、長(zhǎng)寬比和千粒質(zhì)量上極顯著高于小粒等位變異的品種，而粒寬卻極顯著低于小粒等位變異的品種（表2）。

由于基因GLW7大粒型等位變異在秈、粳稻中的分布存在明顯差異，為進(jìn)一步明確GLW7基因不同等位變異在水稻亞種中的效應(yīng)，在秈、粳分類的基礎(chǔ)上根據(jù)對(duì)基因型的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在秈稻中，含GLW7大粒等位變異的品種粒長(zhǎng)、長(zhǎng)寬比、千粒質(zhì)量極顯著高于小粒等位變異品種，其粒長(zhǎng)平均增加11.79%，千粒質(zhì)量平均增加7.96%，但二者的粒寬和粒厚卻沒(méi)有顯著差異（表3）。而在粳稻品種中，兩種基因型品種的粒長(zhǎng)和千粒質(zhì)量存在極顯著差異，在粒厚上存在顯著差異，但粒寬卻沒(méi)有顯著差異，含GLW7大粒等位變異的粳稻品種粒長(zhǎng)和千粒質(zhì)量分別比小粒等位變異的粳稻品種增加2.23%和4.32%（表4）。這也證實(shí)了GLW7基因的大粒型等位變異確實(shí)對(duì)增加粒長(zhǎng)、提高千粒質(zhì)量具有重要的作用。

3討論

表型選擇是傳統(tǒng)育種的主要方法，而基因型、環(huán)境以及它們之間的互作等因素往往影響了育種家對(duì)表型的判斷，因而傳統(tǒng)育種不僅準(zhǔn)確性差，而且周期較長(zhǎng)。分子標(biāo)記輔助選擇可以提高育種的效率和準(zhǔn)確率，在品種選育中具有重要作用[27-29]。本研究基于基因GLW7功能位點(diǎn)的序列差異設(shè)計(jì)了特異性引物，并對(duì)315份來(lái)自國(guó)內(nèi)外水稻品種進(jìn)行基因型檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)只有2種等位變異類型，設(shè)計(jì)的功能標(biāo)記GLW7-F/GLW7-R能夠準(zhǔn)確、高效地區(qū)分不同品種等位變異。對(duì)115份秈稻和200份粳稻的基因型檢測(cè)結(jié)果表明，GLW7基因大粒等位變異在秈稻中占95.65%，而在粳稻中僅占25.50%，說(shuō)明該基因的等位變異在亞種中分布存在明顯的差異。粳稻中大粒型的等位基因頻率較低，這可能與不同地區(qū)對(duì)粳稻粒型的選擇性有關(guān)，也可能與本研究中所用的粳稻材料多為圓粒型，而長(zhǎng)粒型粳稻相對(duì)偏少有關(guān)。

粒型是水稻產(chǎn)量的重要構(gòu)成因素，籽粒的大小和形狀決定了水稻經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的潛力，對(duì)提高千粒質(zhì)量有著重要的影響。對(duì)GLW7基因T-DNA插入突變研究結(jié)果表明，突變體的粒長(zhǎng)，粒厚和粒質(zhì)量均顯著降低[8]。通過(guò)對(duì)315份水稻資源進(jìn)行粒型性狀的測(cè)定分析，發(fā)現(xiàn)GLW7基因2種等位型的品種在粒長(zhǎng)、粒厚及千粒質(zhì)量上均有極顯著的差異?；蛐蜑樾×Ｐ秃痛罅Ｐ偷钠贩N粒寬平均值分別為3.38 mm和2.98 mm，前者明顯大于后者，進(jìn)一步分析結(jié)果表明出現(xiàn)這種現(xiàn)象的根本原因是粳稻和秈稻之間的差異造成的。為深入研究GLW7基因?qū)αＰ偷淖饔眯?yīng)，將315個(gè)水稻品種按秈、粳分為2組分別進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，秈稻中具有大粒等位變異的品種粒長(zhǎng)和千粒質(zhì)量顯著增加，而粒寬和粒厚沒(méi)有明顯差異;粳稻中2種等位變異的品種粒長(zhǎng)和千粒質(zhì)量差異極顯著，粒厚差異顯著，粒寬差異不顯著。這與之前報(bào)道的結(jié)果[8]一致。綜上所述，GLW7基因在秈稻和粳稻中對(duì)粒型不同性狀的效應(yīng)并不完全一樣，這可能是由秈稻和粳稻中不同遺傳背景差異造成的，也可能與粳稻中其他粒型基因的相互作用相關(guān)。

利用分子標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行優(yōu)異基因的聚合是水稻育種的趨勢(shì)[30-31]。在粒型方面， GS3、GW8和GW7基因的聚合，能有效改良水稻的粒型，同時(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)也得到顯著提高[17-18，32-33]。研究結(jié)果證明GLW7基因與GS3基因?qū)ψ蚜５恼{(diào)控是獨(dú)立的通路[8]，推測(cè)聚合這2個(gè)基因可能對(duì)粒型改良有明顯的作用，因而GLW7基因在粒型基因聚合育種中具有較大的潛力。本研究開(kāi)發(fā)的功能標(biāo)記可以有效地區(qū)分GLW7不同的等位變異，為該基因在育種中的利用奠定了基礎(chǔ)。

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