P2Y12基因C34T和G52T位點(diǎn)多態(tài)性與氯吡格雷療效的相關(guān)性研究

趙 敏，陳步星，杜鳳和

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100050)

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·論 著·

P2Y12基因C34T和G52T位點(diǎn)多態(tài)性與氯吡格雷療效的相關(guān)性研究

趙 敏，陳步星，杜鳳和△

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100050)

目的 研究血小板膜受體P2Y12基因C34T和G52T位點(diǎn)多態(tài)性與氯吡格雷療效的相關(guān)性。方法 選取2011年1月1日至2012年1月1日首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院心內(nèi)科收治的規(guī)律服用氯吡格雷的急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者84例為研究對(duì)象。采用單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型檢測(cè)方法檢測(cè)血小板受體基因C34T和G52T，應(yīng)用血栓彈力儀測(cè)定二磷酸腺苷(ADP)途徑誘導(dǎo)的血小板抑制率，觀察血小板膜受體P2Y12基因C34T和G52T位點(diǎn)多態(tài)性與氯吡格雷療效的相關(guān)性。結(jié)果 氯吡格雷血小板抑制率達(dá)標(biāo)58例(達(dá)標(biāo)組)，未達(dá)標(biāo)26例(未達(dá)標(biāo)組)；在C34T基因位點(diǎn)，將所有患者按CC、CT、TT分型，分別為53、31、0例；氯吡格雷血小板抑制率達(dá)標(biāo)組與未達(dá)標(biāo)組基因型分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在G52T基因位點(diǎn)，將所有患者按GG、GT、TT分型，分別為64、19、1例；氯吡格雷血小板抑制率達(dá)標(biāo)組與未達(dá)標(biāo)組基因型分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 血小板膜受體P2Y12基因G52T位點(diǎn)多態(tài)性，可能是影響患者口服氯吡格雷療效的重要因素之一，治療前進(jìn)行基因檢測(cè)有利于指導(dǎo)用藥，降低心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

氯吡格雷； 血小板膜P2Y12基因； 血栓彈力圖

氯吡格雷是一種重要的噻吩并吡啶類(lèi)抗血小板藥物，自1997年應(yīng)用于臨床以來(lái)，就成為了冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(簡(jiǎn)稱(chēng)冠心病)患者，特別是經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)和急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)患者的主要治療用藥[1]。阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷是冠狀動(dòng)脈內(nèi)支架置入術(shù)后的標(biāo)準(zhǔn)用藥，但是應(yīng)用雙重抗血小板治療后，仍有部分患者發(fā)生心血管事件，以支架內(nèi)血栓形成最為嚴(yán)重，其中部分由氯吡格雷抵抗導(dǎo)致[2]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，氯吡格雷抵抗是PCI術(shù)中無(wú)血流的機(jī)制之一，而基因的多態(tài)性可能是引起個(gè)體差異的主要原因[3]。

血小板膜受體P2Y12是氯吡格雷發(fā)揮藥理學(xué)作用的靶點(diǎn)，屬于G蛋白偶聯(lián)受體。目前已經(jīng)確認(rèn)P2Y12基因有5個(gè)位點(diǎn)存在基因多肽現(xiàn)象，分別為I-C139T、i-T744C、i-ins801A、C34T和G52T[4]。研究發(fā)現(xiàn)，30%的氯吡格雷抵抗與基因有關(guān)，主要表現(xiàn)為血小板P2Y12受體基因的多態(tài)性、受體數(shù)量的增加及受體信號(hào)傳導(dǎo)障礙[5-6]。到目前為止，我國(guó)關(guān)于血小板膜受體基因多態(tài)性與氯吡格雷療效的研究并不多。本研究旨在探討血小板膜受體P2Y12基因C34T、G52T位點(diǎn)多態(tài)性與氯吡格雷療效的相關(guān)性，為指導(dǎo)冠心病患者尤其是PCI術(shù)后長(zhǎng)期服用氯吡格雷治療的患者的合理用藥提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年1月1日至2012年1月1日本院明確診斷為ACS的住院患者84例為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者為漢族，18歲以上，服用氯吡格雷75 mg/d，5 d以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)氯吡格雷過(guò)敏或不能耐受者；半年內(nèi)有內(nèi)臟出血性疾病史者；嚴(yán)重肝臟疾患和(或) 凝血功能異常者；具有抗血小板治療禁忌證或近期擬行外科手術(shù)者；具有瓣膜病、心肌病、心肌炎、先天性心臟病、周?chē)懿』蚋腥拘孕膬?nèi)膜炎者；具有晚期腎功能不全、腫瘤及慢性心力衰竭等嚴(yán)重影響近期預(yù)后疾病者。

1.2 儀器與試劑 TEG5000血栓彈力儀(美國(guó)Haemoscope公司)，試劑：高嶺土(含l%的高嶺土液)、激活劑F(由蝮蛇血凝酶和血小板ⅩⅢa因子混合而成)及二磷酸腺苷(ADP)，均購(gòu)自Haemoscope公司。電泳儀(北京六一儀器廠)、電泳槽(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)、BioSens SC 810B凝膠成像儀(上海山富科學(xué)儀器有限公司)、5810R離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)、9700聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀及3730XL測(cè)序儀(美國(guó)ABI公司)，試劑：ABI PRISM?SNaPshotTM多重單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析試劑盒(美國(guó)ABI公司)、Taq 聚合酶(日本TaKaRa公司)及PCR純化試劑盒(天根生化科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本收集 患者服用氯吡格雷5 d、75 mg/d，禁食12 h后于清晨抽取外周靜脈血6 mL分別置入枸櫞酸鈉和肝素試管中，用于血小板抑制率的檢測(cè)；另抽取外周靜脈血2 mL，-20 ℃儲(chǔ)存，用于DNA提取及基因檢測(cè)。

1.3.2 血小板抑制率檢測(cè) 抽取靜脈血后2 h內(nèi)完成血小板抑制率檢測(cè)。在服用氯吡格雷的情況下，由2 μmol/L的ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率不低于70%，即抑制率小于30%，為氯吡格雷反應(yīng)低下[9]。

1.3.3 DNA提取及基因檢測(cè) 提取并純化所有患者外周血DNA，根據(jù)SNP位點(diǎn)序列信息，使用Primer與軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和延伸引物并合成；采用3730XL測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)得到的原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入到分析軟件中進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 C34T與G52T位點(diǎn)基因分型后患者一般資料比較 在C34T基因分型中，CC型53例、CT型31例、TT型0例；根據(jù)是否攜帶T基因?qū)⑺谢颊叻譃閮山M，兩組患者的年齡、性別、吸煙史及高血壓、糖尿病、陳舊性心肌梗死(OMI)、AMI史等一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在G52T基因分型中，GG型64例、GT型19例、TT型1例；同樣根據(jù)是否攜帶T基因?qū)⑺谢颊叻譃閮山M，兩組患者的年齡、性別、吸煙史及高血壓、OMI、AMI史等一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而兩組糖尿病患病率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 血小板P2Y12受體基因C34T與G52T位點(diǎn)不同基因型的臨床基本資料比較(n=84)

2.2 C34T與G52T位點(diǎn)基因型分布與氯吡格雷血小板抑制率的關(guān)系 84例患者中氯吡格雷血小板抑制率達(dá)標(biāo)58例(達(dá)標(biāo)組)，未達(dá)標(biāo)26例(未達(dá)標(biāo)組)。在C34T位點(diǎn)，兩組基因型分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在G52T位點(diǎn)，兩組基因型分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 C34T與G52T位點(diǎn)基因型分布與氯吡格雷 血小板抑制率的關(guān)系[n(%)]

3 討 論

氯吡格雷是一種廣泛應(yīng)用于臨床的抗血小板藥物，是目前不穩(wěn)定型心絞痛、急性心肌梗死和PCI治療的基石，能夠改善動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的近期和遠(yuǎn)期預(yù)后。但研究發(fā)現(xiàn)，患者對(duì)抗血小板藥物的反應(yīng)存在明顯的個(gè)體差異，“標(biāo)準(zhǔn)方案”氯吡格雷并不能使所有患者都獲得相同的益處，因此藥物反應(yīng)的多樣性越來(lái)越受到關(guān)注。

氯吡格雷的活性代謝產(chǎn)物選擇性并不可逆地與血小板表面ADP受體P2Y12結(jié)合，減少ADP結(jié)合位點(diǎn)，阻斷ADP對(duì)腺苷酸環(huán)化酶的抑制作用，促進(jìn)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)依賴(lài)和前列腺素E1(PGE1)刺激的血管擴(kuò)張刺激磷蛋白(VASP)的磷酸化，抑制纖維蛋白原受體(糖蛋白GPⅡb/Ⅲa)活化進(jìn)而抑制血小板的聚集。而血小板膜P2Y12受體基因的突變可引起P2Y12受體蛋白氨基酸的變異，使P2Y12受體的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響P2Y12受體激活[7]。故血小板ADP受體P2Y12基因的多態(tài)性，可影響氯吡格雷的血小板抑制作用。

Fontana等[4]對(duì)98例健康受試者進(jìn)行P2Y12基因序列的變異性分析，結(jié)果顯示，86%的單倍體為H1單倍體，14%為H2單倍體。研究發(fā)現(xiàn)，H2單倍體攜帶者容易發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化性疾病，并且對(duì)氯吡格雷的治療效應(yīng)降低。Fontana等[8]進(jìn)行的病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，H2單倍體攜帶者與外周動(dòng)脈疾病的發(fā)生有關(guān)。Ziegler等[9]也發(fā)現(xiàn)P2Y12基因變異可增加外周動(dòng)脈疾病患者服用氯吡格雷后腦血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，攜帶至少1個(gè)34T變異的患者發(fā)生缺血性腦卒中和(或)頸動(dòng)脈血管重建術(shù)的概率是只攜帶34C變異患者的4倍。王建軍[10]研究發(fā)現(xiàn)，C34T基因位點(diǎn)C→T的突變可能是氯吡格雷抵抗的危險(xiǎn)因子，其作用獨(dú)立于CPY2C19基因多態(tài)性之外。

本研究84例患者入院后開(kāi)始口服氯吡格雷治療，并進(jìn)行了氯吡格雷的血小板抑制率檢測(cè)。記錄患者口服氯吡格雷后的血小板抑制率，分別針對(duì)C34T、G52T位點(diǎn)進(jìn)行氯吡格雷血小板抑制率達(dá)標(biāo)與未達(dá)標(biāo)的定性分析。其中氯吡格雷血小板抑制率達(dá)標(biāo)58例，未達(dá)標(biāo)26例。在C34T位點(diǎn)，將84例患者按CC、CT、TT進(jìn)行基因分型，各53、31、0例；氯吡格雷血小板抑制率達(dá)標(biāo)組與未達(dá)標(biāo)組基因型分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在G52T位點(diǎn)，將84例患者按GG、GT、TT進(jìn)行基因分型，各64、19、1例；氯吡格雷血小板抑制率達(dá)標(biāo)組與未達(dá)標(biāo)組基因型分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明在口服氯吡格雷的患者中，血小板膜受體P2Y12基因G52T的多態(tài)性，可能是影響患者口服氯吡格雷療效的重要因素之一，而C34T的多態(tài)性與其關(guān)系不明顯。

綜上所述，氯吡格雷是目前臨床常規(guī)應(yīng)用的抗血小板聚集藥物，而其效果受基因多態(tài)性的影響，因此開(kāi)展氯吡格雷基因多態(tài)性的研究具有非常重要的意義。如果能在抗血小板治療前對(duì)患者的上述基因型進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)不同患者的基因型變異情況選擇藥物和給藥方案，不但有利于患者的個(gè)體化治療，還有利于降低心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。但是，還需要大規(guī)模的人群前瞻性基因多態(tài)性篩查和隨機(jī)臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。

[1]Yusuf S，Zhao F，Mehta SR，et al．Efects of clopidogrel in addition to aspirin in patients with acute coronary syndromes without ST-segment elevation[J]．N Engl J Med，2001，345(7)：494-502．

[2]Vlachojannis GJ，Dimitropoulos G，Alexopoulos D．Clopidogrel resistance:current aspects and future directions[J]．Hellenic J Cardiol，2011，52(3)：236-245．

[3]Bozbeyoglu E，Satilmis S，Aksu H，et al．Impact of clopidogrel resistance on ST-segment resolution and no-reflow in acute myocardial infarction with ST-elevation patients treated with a primary percutaneous coronary intervention[J]．Coron Artery Dis，2012，23(8)：523-527．

[4]Fontana P，Dupont A，Gandrille S，et al．Adenosine diphosphate-induced platelet aggregation is associated with P2Y12 gene sequence variations in healthy subjects [J]．Circulation，2003，108(8)：989-995．

[5]Pena A，Collet JP，Hulot JS，et al．Can we override clopidogrel resistance [J]．Circulation，2009，119(21)：2854-2857．

[6]Simon T，Verstuyft C，Mary-Krause M，et al．Genetic determinants of response to clopidogrel and cardiovascular events[J]．N Engl J Med，2009，360(4)：363-375．

[7]Robio JC，Martin MA，Rabadan M，et al．Frequency of the C34T mutation of the AMPD1 gene in world-class endurance athletes:dose this mutation impair performance [J]．J Appl Physiol，2005，98(6)：2108-2112．

[8]Fontana P，Gaussern P，Aiach M，et al．P2Y12 H2 haplotype is associated with peripheral arterial disease:a case-control study[J]．Circulation，2003，108(24)：297l-2973．

[9]Ziegler S，Schillinger M，F(xiàn)unk M，et al．Association of a functional polymorphism in the clopidogrel target receptor gene,P2Y12,and the risk for ischemic cerebrovascular events in patients with peripheral artery disease[J]．Stroke，2005，36(7)：1394-1399．

[10]王建軍．血小板P2Y12受體基因(C34T、G52T、iT744C)多態(tài)性對(duì)冠心病患者氯吡格雷抵抗的影響[D]．福州：福建醫(yī)科大學(xué)，2009．

Association between P2Y12 gene C34T and G52T platelet receptor polymorphisms and clopidogrel efficacy

ZHAOMin，CHENBu-xing，DUFeng-he△

(DepartmentofCardiology，BeijingTiantanHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100050，China)

Objective To study the correlation between platelet receptor P2Y12 gene C34T and G52T sites polymorphism with clopidogrel efficacy.Methods 84 patients with acute coronary syndrome in the internal medicine department of Beijing Tiantan Hospital from 1st Jan. 2011 to 1st Jan. 2012 received the regular oral clopidogrel treatment.The platelet receptor P2Y12 gene C34T and G52T sites polymorphism was detected by the single nucleotide polymorphisms typing.The platelet inhibition ratio induced by the ADP pathway was detected by the thromboelastography.The correlation between platelet receptor P2Y12 gene C34T and G52T sites polymorphism with clopidogrel efficacy was observed.Results 58 cases reached the standard of clopidogrel platelet inhibition ratio and 26 cases did not reach the standard.By the C34T genotyping in 84 cases,the type CC,CT and TT were 53 cases,31 cases and 0 case respectively.At the C34T gene site,no statistical significant difference was found in the frequency of distribution of genotypes between patients reached the standard and patients did not reach the standard(P>0.05).At the G52T gene site,statistical significant difference was found in the frequency of distribution of genotypes between patients reached the standard and patients did not reach the standard(P<0.05).Conclusion Platelet receptor P2Y12 gene G52T site polymorphism may be one of important factors affecting oral clopidogrel efficacy.Conducting the gene detection could be conducive to guide the medication and decrease the risk of cardiovascular event occurrence.

clopidogrel； platelet receptor P2Y12 gene； thrombelastogram

趙敏，女，本科，主治醫(yī)師，主要從事冠心病臨床研究?！?/p>

，E-mail：fhduu@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.05.019

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1672-9455(2015)05-0628-03

2014-10-26

2014-12-28)