泛素蛋白酶體抑制劑的分子機制

李 明 綜述，劉躍亮 審校

(1.重慶市巫溪縣人民醫(yī)院檢驗科 405800；2.重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院，重慶 400000)

?

·綜 述·

泛素蛋白酶體抑制劑的分子機制

李 明1綜述，劉躍亮2審校

(1.重慶市巫溪縣人民醫(yī)院檢驗科 405800；2.重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院，重慶 400000)

泛素化； 蛋白酶復(fù)合物； 抑制劑； 分子機制

生物體細(xì)胞在精細(xì)的調(diào)節(jié)之下進行蛋白質(zhì)合成，這有助于維持機體細(xì)胞的正常增殖、分化和代謝運轉(zhuǎn)，以及選擇性地降解多余無用的蛋白質(zhì)。泛素化蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)，是機體內(nèi)蛋白質(zhì)降解的另一主要方式。該系統(tǒng)步驟多、過程復(fù)雜，主要包括底物蛋白質(zhì)的多泛素化修飾和26S蛋白水解酶復(fù)合物對底物蛋白質(zhì)的降解。由機體細(xì)胞自然識別程序識別出需要降解的蛋白質(zhì)，泛素蛋白分子通過共軛雙鍵與底物蛋白質(zhì)連接形成標(biāo)簽蛋白(即泛素降解底物蛋白質(zhì))，再被26S蛋白水解酶復(fù)合物系統(tǒng)識別并水解。針對泛素化蛋白酶降解系統(tǒng)的抑制劑(即泛素蛋白酶體抑制劑)，不僅可以促進機體有害代謝物的清理，還表現(xiàn)出明顯的抗癌效果，該抑制劑已經(jīng)被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)作為部分實體性腫瘤治療的一線用藥。但是，眾多臨床試驗已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該抑制劑具有不可忽略的不良反應(yīng)且不具有經(jīng)口服的生物可利用特性，這在很大程度上影響其廣泛地應(yīng)用于臨床。本文就泛素蛋白酶體抑制劑的分子機制進行綜述，為其在新藥開發(fā)、臨床前試驗研究和實體性腫瘤的臨床治療評估提供理論依據(jù)。

1 泛素化、去泛素化和蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)

細(xì)胞內(nèi)環(huán)境或外界環(huán)境中某些信號分子的刺激啟動細(xì)胞凋亡程序，再通過識別需要降解的蛋白質(zhì)，如損傷的蛋白質(zhì)或錯誤折疊的蛋白質(zhì)，以及無生物功能的廢棄蛋白質(zhì)等，啟動泛素化蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)。泛素化蛋白質(zhì)降解主要通過兩個步驟來完成：底物蛋白質(zhì)(即待降解蛋白質(zhì))的多泛素化和以水解方式降解底物蛋白質(zhì)[1]。該過程包括許多其他蛋白質(zhì)和酶的參與、復(fù)雜而精細(xì)的蛋白質(zhì)間的作用和其他生化反應(yīng)。

1.1 泛素化蛋白酶復(fù)合體 泛素化蛋白酶復(fù)合體主要由泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)和泛素連接酶(E3)構(gòu)成。在所有泛素化修飾的類型中，研究較透徹的是第48位賴氨酸連接的泛素化修飾(K48)和第63位賴氨酸連接的泛素化修飾(K63)。前者的主要功能是對底物蛋白質(zhì)進行標(biāo)記，使蛋白酶體能夠特異地識別并降解被修飾的蛋白；后者的主要功能是通過修飾作用賦予底物蛋白質(zhì)新的生物功能而不會導(dǎo)致其降解，如使其具有蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運或開啟其他信號通路的功能。

1.2 底物蛋白質(zhì)的多泛素化 多泛素化修飾過程主要包括：(1)泛素活化，即泛素分子的C末端與E1半胱氨酸殘基共價連接形成硫酯鍵。具體過程：胞質(zhì)中存在的游離的、由76個氨基酸構(gòu)成的泛素分子在三磷腺苷(ATP)的參與下被泛素活化酶激活后，泛素分子的第76位甘氨酸(Gly)與泛素活化酶上特殊的半胱氨酸(Cys)殘基形成一個高能硫酯鍵，然后將轉(zhuǎn)酯作用活化的泛素分子從泛素活化酶轉(zhuǎn)移到泛素結(jié)合酶的Cys上[2]，釋放出泛素活化酶，形成泛素結(jié)合酶-泛素復(fù)合物，使底物蛋白質(zhì)發(fā)生泛素化。(2)在E3連接酶參與下，泛素分子從泛素結(jié)合酶-泛素復(fù)合物上脫離，通過共價連接的硫酯鍵連接到底物蛋白質(zhì)的賴氨酸(Lys)殘基上，形成泛素-底物蛋白質(zhì)復(fù)合物。最后，多個泛素分子重復(fù)地連接到已經(jīng)被泛素化的待降解蛋白質(zhì)，形成多泛素鏈。E3連接酶是指環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其主要功能是拉近E2結(jié)合酶與底物之間的距離，最終使泛素充分接近底物蛋白質(zhì)的Lys殘基；少數(shù)E3連接酶含有HECT結(jié)構(gòu)域[3]，其在轉(zhuǎn)移泛素分子到底物蛋白之前，先與泛素通過共價結(jié)合為中間體，促進繼續(xù)泛素化，由單泛素化延長成多泛素鏈。通常至少需要4個泛素殘基，才能被26S蛋白酶體識別并降解目的蛋白質(zhì)[4]。

1.3 泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解 有機生物體內(nèi)負(fù)責(zé)聚泛素化蛋白質(zhì)降解的蛋白酶復(fù)合體是26S蛋白酶復(fù)合體，主要由具有催化功能的20S核心顆粒和具有受體作用的覆蓋其兩端蓋狀結(jié)構(gòu)的19S調(diào)節(jié)顆粒組成。經(jīng)泛素活化的底物蛋白質(zhì)聚集到26S蛋白酶體周圍，與蛋白酶體19S的泛素受體相互作用，多泛素化蛋白質(zhì)被執(zhí)行去泛素化和打開蛋白質(zhì)的折疊結(jié)構(gòu)，去折疊后的蛋白質(zhì)再通過兩個孔狀結(jié)構(gòu)進入26S蛋白酶復(fù)合體的20S核心顆粒內(nèi)部。經(jīng)酶催化的多次切割，最終形成3～22個氨基酸殘基的小肽。與其他的翻譯后修飾類似，泛素化修飾是一個可逆的過程，泛素鏈能夠被去泛素化酶移除，分解為單個泛素分子被循環(huán)再利用。

1.4 去泛素化 去泛素，是指泛素化蛋白質(zhì)在特異性水解酶 (去泛素化酶) 的作用下，多泛素鏈被解離為單個泛素分子，可再次參與泛素化過程。去泛素化酶(DUB)與泛素化蛋白酶體復(fù)合物，在一定程度上存在競爭關(guān)系。DUB屬于蛋白酶體超家族，根據(jù)其催化亞基結(jié)構(gòu)的不同，分為泛素C 末端水解酶家族(UCH)、含JAB1/PAB1/MPN 結(jié)構(gòu)域的金屬蛋白酶家族(JAMM)、泛素特異性蛋白酶家族(USP)、卵巢癌蛋白酶家族(OTU)和MJD 結(jié)構(gòu)域蛋白酶家族[5]。在真核細(xì)胞內(nèi)已發(fā)現(xiàn)多種DUB，它們能利用活性硫醇位點將泛素與底物蛋白質(zhì)拆開[3]。DUB能水解泛素和底物蛋白質(zhì)之間的硫酯鍵，還能把錯誤識別的底物從泛素化復(fù)合體中釋放出來，并重新釋放出泛素分子。19S蛋白酶體的底座蛋白質(zhì)成分在打開底物蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)后，具有運輸未折疊的蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)移去泛素化底物蛋白到催化核心顆粒等作用。20S核心催化顆粒由4層指環(huán)狀結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)包裹[6]。外層指環(huán)狀結(jié)構(gòu)由7個α亞單位構(gòu)成，分別是α1～α7，而內(nèi)層為7個β指狀結(jié)構(gòu)，分別為β1～β7，β1亞單位具有半胱氨酸蛋白酶樣(C-L)水解活性，β2具有胰蛋白酶樣(T-L)水解活性，β5亞單位表現(xiàn)糜蛋白酶(CT-L)活性[7]。

2 泛素-蛋白酶體抑制劑相關(guān)的信號通路

2.1 人乳頭瘤病毒(HPV)感染與p53蛋白的泛素化 p53是一種腫瘤抑制蛋白質(zhì)，具有轉(zhuǎn)錄因子作用，參與細(xì)胞周期抑制調(diào)節(jié)，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。p53表達水平是在泛素蛋白酶系統(tǒng)的嚴(yán)密調(diào)控下進行的[8]。HDM2是一個指狀的E3連接酶，與p300/CBP組合為一種復(fù)合物，促進多泛素化和p53蛋白的快速降解[9]。因此，在抗腫瘤治療研究中，抑制p53蛋白與HDM2蛋白的相互作用及抑制蛋白酶體活性成為研究的關(guān)鍵點，可通過這種方案來增加p53蛋白的細(xì)胞內(nèi)水平。當(dāng)然，前提是腫瘤細(xì)胞可以表達野生型的p53蛋白。但是，多數(shù)腫瘤細(xì)胞都發(fā)生了p53基因的突變或缺失，因此給抗腫瘤藥物的設(shè)計帶來了限制。研究表明HPV自身的E6蛋白(HPV-E6)及相關(guān)蛋白具有HECT結(jié)構(gòu)域E3連接酶作用，可促進泛素化蛋白酶體對p53蛋白的降解。p53蛋白很容易通過HPV-E6蛋白介導(dǎo)的程序發(fā)生轉(zhuǎn)移，使HPV感染相關(guān)腫瘤，如多數(shù)的子宮癌和越來越多的頭頸部腫瘤，具有低選擇性的突變或缺失p53基因[8，10]。所以，幾乎所有的HPV感染陽性的宮頸癌和頭頸部腫瘤都保留著表達野生型p53蛋白的特性。由此認(rèn)為，如果抑制HPV病毒E6蛋白酶表達，在一定程度上，可以促進野生型p53蛋白在HPV陽性實體腫瘤的表達增強。

2.2 細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制劑p27泛素化 細(xì)胞周期素與蛋白激酶(CDK)的生物活性狀態(tài)密切相關(guān)，可促進CDK的活化和細(xì)胞周期運行。約超過15種細(xì)胞周期素存在于人類基因組[7]。細(xì)胞周期素表達水平是轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)和蛋白酶體降解嚴(yán)密調(diào)控的結(jié)果。抑制蛋白酶體降解活性，可導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白的異常表達，從而促進不恰當(dāng)?shù)腃DK活化、啟動細(xì)胞周期進程，導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂。這一特點可以為腫瘤治療提供有用的研究靶點，如啟動細(xì)胞凋亡和程序性的有絲分裂中斷機制。另外，p27蛋白對調(diào)節(jié)靜止期細(xì)胞進入細(xì)胞周期有著重要的作用[10]。由轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β)介導(dǎo)的細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用所引起的細(xì)胞周期抑制，部分由p27蛋白參與。泛素化蛋白酶體降解p27蛋白后，可以恢復(fù)細(xì)胞周期進程，該生物現(xiàn)象通過一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)完成，其中涉及環(huán)指狀E3連接酶與SCFSkp2 復(fù)合[11]。另有研究表明，E3連接酶片段SCFSkp2復(fù)合物的生物活性需要泛素樣多肽蛋白NEDD8黏附到SCFSkp2復(fù)合物上形成蛋白復(fù)合物后，才能被泛素蛋白酶體所識別[12-13]。所以，致力于NEDD8蛋白抑制劑，可通過恢復(fù)p27蛋白的生物活性阻滯過度增殖的腫瘤細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞停滯于細(xì)胞周期的某一階段，為抗腫瘤研究提供新思路。

2.3 促凋亡蛋白Bcl-2蛋白家族泛素化降解 Li等[14]研究表明，抑制泛素化蛋白酶體可導(dǎo)致促凋亡蛋白Bcl-2蛋白家族成員高表達，包括Noxa、Bax和Bik等蛋白表達上調(diào)。此外，關(guān)于使用反義寡核苷酸或干擾RNA(siRNA)或短發(fā)夾RNA(shRNA)的研究已經(jīng)表明，在部分腫瘤的細(xì)胞模型中，如骨肉瘤、頭勁部腫瘤、結(jié)胞癌等，Bcl-2蛋白家族成員可通過泛素化蛋白酶體誘導(dǎo)降解的方式參與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15-17]。在利用泛素蛋白酶體抑制劑處理部分實體性腫瘤細(xì)胞時，Noxa和Bax等蛋白質(zhì)表達增加時，p53表達水平提高，其具體機制尚不清楚。此外，泛素蛋白酶體抑制劑還可促進MCL-1蛋白質(zhì)(一種具有抗細(xì)胞凋亡作用的Bcl-2家族成員之一)的表達增加[18]。而MCL-1是一個直接的泛素化蛋白酶底物[19]，可以抑制細(xì)胞凋亡，泛素蛋白酶體抑制劑和MCL-1表達抑制劑共同處理腫瘤細(xì)胞，可增強泛素蛋白酶體抑制劑促進細(xì)胞凋亡的作用。事實上，MCL-1抑制劑，如obatoclax(GX15-070)或針對MCL-1蛋白表達的mRNA和shRNA，已經(jīng)被證明具有明顯提高泛素蛋白酶體抑制劑殺死血液系統(tǒng)腫瘤或?qū)嶓w腫瘤細(xì)胞的作用[20]。

2.4 腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體和NF-κB信號通路的泛素化抑制 死亡配體腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)與細(xì)胞質(zhì)膜受體DR4和DR5結(jié)合后，可誘導(dǎo)外源性細(xì)胞凋亡通路活化[20]。泛素化蛋白酶體抑制劑作用于部分腫瘤細(xì)胞后，表現(xiàn)出DR4和DR5的表達上調(diào)，從而增強對TRAIL受體的敏感性。臨床前實驗已經(jīng)表明，蛋白酶體抑制劑作用于TRAIL后，具有明顯的抑制實體腫瘤細(xì)胞增殖的效果。

多種血液性腫瘤和實體惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)，NF-κB因子處于過表達和(或)過度活化狀態(tài)。通常情況下，NF-κB以無活性形式存在，被胞質(zhì)中的內(nèi)源性抑制劑κB(IκB)所控制；活化后的NF-κB因子，可誘導(dǎo)多種與細(xì)胞增殖和存活相關(guān)基因的過表達和腫瘤組織血管生成異?；钴S。NF-κB被外源刺激物激活，涉及IκB的磷酸化、泛素化及蛋白酶體降解[21,24]。游離的NF-κB則遷移到細(xì)胞核內(nèi)并促進相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。部分泛素化蛋白酶體抑制劑的抗腫瘤研究，也是針對抑制IκB的降解而抑制結(jié)構(gòu)性活化的NF-κB因子的促癌作用。

3 小 結(jié)

泛素蛋白酶體抑制劑，在實體性腫瘤治療中已初見成效。目前，在抗實體性腫瘤的臨床研究中，第一代泛素蛋白酶體抵制劑，如硼替佐米已經(jīng)投入應(yīng)用。而第二代抵制劑，主要針對第一代藥物的不足而研究設(shè)計，如增強抑制劑對實體性腫瘤細(xì)胞的敏感性，使其可以通過口服應(yīng)用，或研究其他更利于開展臨床應(yīng)用的方案。在作用機制方面，也增加了更多的抑制位點或通過對不同的生物信號通路進行調(diào)控，間接調(diào)控促進細(xì)胞凋亡與抑制細(xì)胞凋亡之間的平衡，如針對去泛素酶作用藥物的作用靶點，通過泛蛋白酵素來調(diào)節(jié)去泛素酶的水平[22]。而Chauhan等[23]研究表明，小分子物質(zhì)(P5091)可以作為泛蛋白酵素酶的抑制劑，對硼替佐米耐藥的腫瘤細(xì)胞，通過誘導(dǎo)其凋亡而產(chǎn)生抗實體性腫瘤的作用。Li等[24]研究證實泛素蛋白酶體抑制劑可誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞對實體性腫瘤細(xì)胞的抗原提呈作用來發(fā)揮機體自身免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。此外，被誘導(dǎo)的吞噬細(xì)胞還具有增強正常細(xì)胞的生存能力和增加異質(zhì)細(xì)胞對抑制劑藥物的敏感性的作用?？傊?，泛素蛋白酶體抑制劑的研究與應(yīng)用，還需要大量的、有價值的研究工作和研究數(shù)據(jù)的支撐，因此應(yīng)該積極地關(guān)注新的研究發(fā)現(xiàn)和進展。

[1]Shen M，Schmitt S，Buac D，et al．Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy[J]．Exp Opin Ther Targets，2013，17(9)：1091-1108．

[2]Zhang N，Chen T，Liu C，et al．Inhibition of ubiquitin protein expression and 20S proteasome activity by irbesartan prevents post-infarction ventricular remodeling and decreases TNF-α generation[J]．Biomed Rep，2013，1(6)：935-939．

[3]Spratt DE，Walden H，Shaw GS．RBR E3 ubiquitin ligases:new structures,new insights,new questions[J]．Biochem J，2014，458(3)：421-437．

[4]Gallastegui N，Groll M．The 26S proteasome:assembly and function of a destructive machine[J]．Trends Biochem Sci，2010，35(11)：634-642．

[5]Li J，D′Angiolella V，Seeley ES，et al．USP33 regulates centrosome biogenesis via deubiquitination of the centriolar protein CP110[J]．Nature，2013，495(7440)：255-259．

[6]Winkler LL，Hwang J，Kalejta RF．Ubiquitin-independent proteasomal degradation of tumor suppressors by human cytomegalovirus pp71 requires the 19S regulatory particle[J]．J Virol，2013，87(8)：4665-4671．

[7]Liu X，Xiao W，Wang XD，et al．The p38-interacting protein (p38IP) regulates G2/M progression by promoting α-tubulin acetylation via inhibiting ubiquitination-induced degradation of the acetyltransferase GCN5[J]．J Biol Chem，2013，288(51)：36648-36661．

[8]Chaturvedi AK，Engels EA，Pfeiffer RM，et al．Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States[J]．J Clin Oncol，2011，29(32)：4294-4301．

[9]Pan W，Lahue BR，Ma Y，et al．Core modification of substituted piperidines as Novel inhibitors of HDM2-p53 protein-protein interaction[J]．Bioorg Med Chem Lett，2014，24(8)：1983-1986．

[10]肖春海，吳娟芳．人類乳頭瘤病毒分型在宮頸早期病變中的臨床意義[J]．檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2012，9(22)：2794-2795．

[11]Chen L，Wu T，Wei TQ，et al．Skp2-mediated degradation of p27 regulates cell cycle progression in compressed human bladder smooth muscle cells[J]．Kaohsiung J Med Sci，2014，30(4)：181-186．

[12]Weathington NM，Mallampalli RK．Emerging therapies targeting the ubiquitin proteasome system in cancer[J]．J Clin Invest，2014，124(1)：6-12．

[13]Ungermannova D，Lee J，Zhang G，et al．High-throughput screening AlphaScreen assay for identification of small-molecule inhibitors of ubiquitin E3 ligase SCFSkp2-Cks1[J]．J Biomol Screen，2013，18(8)：910-920．

[14]Xu GW，Toth JI，da Silva SR，et al．Mutations in UBA3 Confer Resistance to the NEDD8-Activating Enzyme Inhibitor MLN4924 in Human Leukemic Cells[J]．PLoS One，2014，9(4)：1-10．

[15]Li T，Ho L，Piperdi B，et al．Phase II study of the proteasome inhibitor bortezomib (PS-341,Velcade) in chemotherapy-na?ve patients with advanced stage non-small cell lung cancer (NSCLC)[J]．Lung Cancer，2010，68(1)：89-93．

[16]Bedford L，Lowe J，Dick LR，et al.Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets[J]．Nat Rev Drug Discov，2011，10(1)：29-46．

[17]van Dijk M，Murphy E，Morrell R，et al．The proteasome inhibitor bortezomib sensitizes AML with myelomonocytic differentiation to TRAIL mediated apoptosis[J]．Cancers，2011，3(1)：1329-1350．

[18]Kahana S，F(xiàn)inniss S，Cazacu S，et al．Proteasome inhibitors sensitize glioma cells and glioma stem cells to TRAIL-induced apoptosis by PKCε-dependent downregulation of AKT and XIAP expressions[J]．Cell Signall，2011，23(8)：1348-1357．

[19]Zang Y，Thomas SM，Chan ET，et al．Carfilzomib and ONX 0912 inhibit cell survival and tumor growth of head and neck cancer and their activities are enhanced by suppression of Mcl-1 or autophagy[J]．Clin Cancer Res，2012，18(20)：5639-5649．

[20]Doi K，Li R，Sung SS，et al．Discovery of marinopyrrole A (maritoclax) as a selective Mcl-1 antagonist that overcomes ABT-737 resistance by binding to and targeting Mcl-1 for proteasomal degradation[J]．J Biol Chem，2012，287(13)：10224-10235．

[21]Yang QH，Xu YJ，F(xiàn)eng GF，et al．Effects of soothing liver and invigorating spleen recipes on NF-kappaB signal pathway related genes and proteins in primary hepatocytes of rats with NASH[J]．Zhong Yao Cai，2013，36(9)：1469-1467．

[22]Fraile JM，Quesada V，Rodriguez D，et al．Deubiquitinases in cancer:new functions and therapeutic options[J]．Oncogene，2012，31(19)：2373-2388．

[23]Chauhan D，Tian Z，Nicholson B，et al．A small molecule inhibitor of ubiquitin-specific protease-7 induces apoptosis in multiple myeloma cells and overcomes bortezomib resistance[J]．Cancer Cell，2012，22(3)：345-358．

[24]Li C，Johnson DE．Bortezomib induces autophagy in head and neck squamous cell carcinoma cells via JNK activation[J]．Cancer Letter，2012，314(1)：102-107．

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.05.047

A

1672-9455(2015)05-0691-03

2014-10-26

2014-11-20)