3種實(shí)驗(yàn)技術(shù)在多發(fā)性骨髓瘤檢測(cè)中的應(yīng)用

蘆 晗，王志銀，李 強(qiáng)△(.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000;.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南新鄉(xiāng) 45300)

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3種實(shí)驗(yàn)技術(shù)在多發(fā)性骨髓瘤檢測(cè)中的應(yīng)用

蘆 晗1，王志銀2，李 強(qiáng)2△(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南新鄉(xiāng) 453100)

目的 評(píng)估形態(tài)學(xué)、免疫組化和流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)在多發(fā)性骨髓瘤(MM)檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。方法收集新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2013年9月至2014年5月MM患者30例，采用免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)分析骨髓瘤細(xì)胞免疫表型，探討其表達(dá)率與骨髓瘤細(xì)胞形態(tài)特征及相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)的關(guān)系。3種檢測(cè)方法組間差異采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，率的比較用χ2檢驗(yàn)。結(jié)果 形態(tài)學(xué)檢測(cè)瘤細(xì)胞比例在6.00%～95.00%，免疫組化檢測(cè)瘤細(xì)胞比例在9.00%～88.00%，流式細(xì)胞檢測(cè)瘤細(xì)胞比例在4.07%～87.42%。形態(tài)學(xué)與免疫組化、形態(tài)學(xué)與流式細(xì)胞之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，免疫組化與流式細(xì)胞之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化與形態(tài)學(xué)3種技術(shù)相結(jié)合，更有助于MM的診斷及預(yù)后判斷。

多發(fā)性骨髓瘤； 流式細(xì)胞術(shù)； 免疫組化； 形態(tài)； 免疫表型

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是以B細(xì)胞起源，骨髓中惡性漿細(xì)胞(瘤細(xì)胞)異常增生和聚集為特征的一種衰竭性、難以治愈的惡性腫瘤，并伴有單克隆免疫球蛋白或其成分(M蛋白)增多。MM好發(fā)于40歲以上中老年人群，近年來，隨著我國(guó)人口老齡化加劇，MM發(fā)病率逐年上升。由于在疾病早期其臨床表現(xiàn)無特異性，極易出現(xiàn)誤診和漏診[1-2]。本文通過免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)對(duì)傳統(tǒng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷的30例MM進(jìn)行細(xì)胞免疫表型分析，并比較3種檢測(cè)方法之間的差異，以期為MM的早期診斷及療效判斷提供更可靠的檢測(cè)方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2013年9月至2014年5月MM患者30例，初診26例，復(fù)查4例；其中男17例，女13例，男∶女=1.31∶1；年齡43～78歲，中位年齡64歲。均符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。初診患者均進(jìn)行骨髓穿刺、血清免疫固定電泳、流式細(xì)胞術(shù)及影像學(xué)等相關(guān)檢查。

1.2 儀器與試劑 流式細(xì)胞儀為BD FACSCalibur，鼠抗人CD38、CD45、CD138、CD19、CD56、胞漿lambda(clambda)、胞漿kappa(ckappa)，破膜劑、溶血素，以上試劑均購(gòu)自美國(guó)BD公司。免疫組化一抗用鼠抗人CD138、Kappa輕鏈、lambda輕鏈單克隆抗體，抗體購(gòu)自河南賽諾特生物公司，二抗用Haopoly-HRP鼠/兔通用二抗試劑盒購(gòu)自上海杰浩生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)用瑞氏染液、免疫組化復(fù)染用蘇木素染液，均由本室配制。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本留取 按常規(guī)方法行骨髓穿刺，取骨髓液0.2 mL涂片做形態(tài)學(xué)和免疫組化檢測(cè)；另抽取2 mL置于肝素抗凝管做流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/L備用，48 h內(nèi)完成檢驗(yàn)。

1.3.2 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查 挑選涂片良好的骨髓片行瑞氏染色，顯微鏡下觀察并分類計(jì)數(shù)200個(gè)有核細(xì)胞，以漿細(xì)胞大于或等于20%并伴形態(tài)異常為MM的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。

1.3.3 免疫組化染色 (1)染色步驟：取新鮮干燥的骨髓涂片，血膜周圍用免疫組化筆畫圈以避免抗體流失，磷酸鹽緩沖液(PBS)浸泡5 min，滴加封閉血清置室溫孵育10 min，甩干，分別滴加適量一抗(CD138、Kappa、lambda)，37 ℃孵育1 h；PBS沖洗3次，每次5 min；滴加適量二抗，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗3次，每次5 min；DAB顯色3～10 min，鏡下觀察，見有明顯棕色沉淀為宜，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片、鏡檢。每次試驗(yàn)均進(jìn)行陰性對(duì)照。(2)陽(yáng)性結(jié)果判斷：在低倍鏡下找尋涂片均勻、薄厚適中、抗原表達(dá)明顯的部位，高倍鏡下細(xì)胞膜、胞漿或胞核顯示棕黃色均勻細(xì)顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，CD138、lambda陽(yáng)性位于胞膜或胞漿，Kappa陽(yáng)性位于胞漿，陰性為不顯色或顯色淺淡。油鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)有核細(xì)胞，分別計(jì)算各抗體陽(yáng)性細(xì)胞所占比例，以10%以上者為陽(yáng)性。

1.3.4 流式細(xì)胞儀分析 按說明書提供的細(xì)胞表面抗原和胞內(nèi)抗原方法標(biāo)記，經(jīng)熒光微球校準(zhǔn)儀器及補(bǔ)償后,用Cell Quest分析軟件獲取20 000個(gè)細(xì)胞，對(duì)數(shù)取樣，通過CD45和CD38/SSC設(shè)門設(shè)定待檢細(xì)胞群，分析各群細(xì)胞抗原表達(dá)情況。以目的細(xì)胞群抗原表達(dá)大于10%為陽(yáng)性。

1.4 觀察指標(biāo) 所有病例確診時(shí)的年齡、性別、臨床表現(xiàn)、血紅蛋白(Hb)、清蛋白(ALB)、肌酐(Cr)、血尿素氮(BUN)、血清鈣濃度(Ca)、β2微球蛋白(β2-MG)、紅細(xì)胞沉降率(ESR)、血清及尿液免疫固定電泳、尿本周蛋白(BJP)等各項(xiàng)檢查結(jié)果逐一記錄并進(jìn)行回顧性分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件處理，率的比較用χ2檢驗(yàn)，均數(shù)組間差異用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學(xué)檢查 26例初診患者均有不同程度的正色素性貧血及免疫球蛋白增多，其中IgG型19例，IgA型7例。骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果主要為異常漿細(xì)胞增生，并伴有質(zhì)的改變。另外4例復(fù)查患者形態(tài)學(xué)檢查均未達(dá)到完全緩解。

2.2 免疫組化結(jié)果 30例MM患者CD138陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)到100.0%，22例Kappa陽(yáng)性，8例lambda陽(yáng)性(表1)。

2.3 流式細(xì)胞檢查結(jié)果 對(duì)目的細(xì)胞群抗原CD38、CD138、CD19、CD45、Kappa、lambda進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn),30例MM中CD19陰性表達(dá)率100.0%；CD45表達(dá)異常(陰性、部分陽(yáng)性)；CD38、CD138陽(yáng)性表達(dá)率均達(dá)到100.0%(表1)。

表1 免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)在30例MM異常漿細(xì)胞抗原表達(dá)形式比較[n(%)]

注：-表示無數(shù)據(jù)。

2.4 3種檢測(cè)方法比較 30例MM患者形態(tài)學(xué)檢查骨髓瘤細(xì)胞中位數(shù)比例為58.00%(6.00%～95.00%)，免疫組化檢測(cè)比例為34.55%(9.00%～88.00%)，流式細(xì)胞檢測(cè)比例為35.74%(4.07%～87.42%)。對(duì)3種方法檢測(cè)到的異常細(xì)胞群所占比例進(jìn)行分析，形態(tài)學(xué)與免疫組化和流式細(xì)胞分析測(cè)定的異常細(xì)胞群比例細(xì)胞檢查之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，免疫組化與流式細(xì)胞檢查之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。另外形態(tài)學(xué)與流式細(xì)胞術(shù)之間有更好的相關(guān)性(r=0.957)。

2.5 免疫組化與流式細(xì)胞檢查診斷敏感性比較 30例MM患者免疫組化結(jié)果陽(yáng)性28例，陽(yáng)性率為93.3%(28/30)，流式細(xì)胞檢查結(jié)果陽(yáng)性27例，陽(yáng)性率為90.0%(27/30)，兩種方法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.215，P>0.05)。

2.6 輕鏈限制性檢測(cè) 30例MM進(jìn)行流式檢測(cè)Kappa限制性表達(dá)22例，lambda限制性表達(dá)8例。

2.7 CD138抗原與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)的關(guān)系 30例MM患者中CD138的表達(dá)與臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)(C反應(yīng)蛋白、BUN、Ca、ALB、β2-MG，ESR)的改變之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

MM在我國(guó)發(fā)病率約為1/10萬，在血液系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率僅次于惡性淋巴瘤[3]。在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中，骨髓形態(tài)學(xué)檢測(cè)是MM診斷最基礎(chǔ)、最普遍的檢測(cè)手段，在一定程度上可以反映治療效果。但骨髓瘤細(xì)胞常呈灶狀分布，臨床上為了提高診斷陽(yáng)性率需要進(jìn)行多次骨髓穿刺，并且當(dāng)骨髓稀釋時(shí)也影響診斷敏感性[4]；在鑒別診斷時(shí)主觀性強(qiáng)，靈敏度低。然而在多數(shù)醫(yī)院對(duì)于MM診斷仍以形態(tài)學(xué)為主，使疾病確診及療效判斷都受到不同程度的限制。因此，本試驗(yàn)采用免疫組化和流式細(xì)胞檢查兩種免疫檢測(cè)方法彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)診斷的不足。

免疫組化根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理可以提高診斷的準(zhǔn)確性，鑒別良、惡性疾病，以及判斷疾病惡性程度，這點(diǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)檢測(cè)。據(jù)報(bào)道，CD19在所有B細(xì)胞和大多數(shù)正常漿細(xì)胞均有表達(dá)，而在MM中不表達(dá)[5-6]；CD138在骨髓造血前體細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中無表達(dá)，但在MM漿細(xì)胞中為陽(yáng)性，具有相對(duì)特異性，便于識(shí)別；而CD38在髓系或B淋巴系統(tǒng)前體細(xì)胞及成熟淋巴細(xì)胞、單核、粒細(xì)胞均有不同程度的表達(dá)，目前認(rèn)為CD138是漿細(xì)胞最特異的指標(biāo)[7]。所以本試驗(yàn)免疫組化選擇CD138聯(lián)合Kappa輕鏈、lambda輕鏈單克隆抗體作為識(shí)別異常漿細(xì)胞的標(biāo)志物。在30例MM患者中，CD138陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)100.0%，Kappa陽(yáng)性率為73.3%，lambda陽(yáng)性率為26.7%，與血清免疫固定電泳結(jié)果一致。

近年來，流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)日漸成熟，當(dāng)骨髓稀釋時(shí)，流式細(xì)胞檢查可以等比降低骨髓漿細(xì)胞比例，優(yōu)于形態(tài)學(xué)檢測(cè)[8]。在正常骨髓中，現(xiàn)代多參數(shù)流式細(xì)胞儀可以足夠敏感地檢測(cè)出至少0.01%的非典型漿細(xì)胞，也能對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行多個(gè)抗原檢測(cè)，同時(shí)對(duì)細(xì)胞表面和胞內(nèi)抗原進(jìn)行分析，并且對(duì)檢測(cè)細(xì)胞的表達(dá)水平可以定量，因此流式細(xì)胞檢查可以很好地識(shí)別并呈現(xiàn)異常漿細(xì)胞各種特征[9-10]。通過檢測(cè)細(xì)胞表面抗原表達(dá)強(qiáng)弱、胞內(nèi)免疫球蛋白是否有輕鏈限制性及異?？乖某霈F(xiàn)，可以把正常和異常漿細(xì)胞區(qū)分開來。正常漿細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)CD38、CD138，表達(dá)CD45，大部分細(xì)胞表達(dá)CD19，不表達(dá)B淋巴系抗原CD20、CD22，無輕鏈限制性。典型MM細(xì)胞的免疫表型特點(diǎn)為：異常表達(dá)CD56，CD38表達(dá)強(qiáng)度稍弱，部分表達(dá)CD117、CD33、CD20，不表達(dá)CD19，CD45表達(dá)弱陽(yáng)性或陰性，有輕鏈限制性[11]。本試驗(yàn)中CD138和CD38陽(yáng)性表達(dá)率均為100.0%。CD19均為陰性表達(dá)，CD45陰性表達(dá)率為93.3%，輕鏈限制性表達(dá)，與上述結(jié)論基本一致，但其中有2例骨髓涂片和免疫組化均超過10%。而流式細(xì)胞檢查未能檢出骨髓瘤細(xì)胞，對(duì)流式細(xì)胞檢查標(biāo)本涂片鏡檢未見瘤細(xì)胞，這可能是由于瘤細(xì)胞灶性分布，流式細(xì)胞檢查標(biāo)本不一定采集到骨髓瘤細(xì)胞而漏檢；也有可能在采集流式細(xì)胞檢查標(biāo)本時(shí)由于技術(shù)問題混入較多血液所致。

免疫組化和流式細(xì)胞檢查聯(lián)合檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)在于通過lambda/Kappa輕鏈限制性表達(dá)確定漿細(xì)胞是否為單克隆性，從而與反應(yīng)性漿細(xì)胞增多鑒別，這在區(qū)分漿細(xì)胞良、惡性方面有重要作用，二者敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于形態(tài)學(xué)檢測(cè)[12]。對(duì)于30例MM患者同時(shí)進(jìn)行形態(tài)學(xué)、免疫組化和流式細(xì)胞檢查檢測(cè)得到以下結(jié)果：骨髓涂片漿細(xì)胞比例與免疫組化、流式細(xì)胞檢查分析測(cè)定的異常細(xì)胞群比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且形態(tài)學(xué)與流式細(xì)胞檢查之間有更好的相關(guān)性(r=0.957)，免疫組化與流式細(xì)胞術(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外對(duì)免疫組化和流式細(xì)胞檢查比較分析，兩種方法檢測(cè)陽(yáng)性率均較高(分別為93.3%和90.0%)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，由此說明免疫組化與流式細(xì)胞檢查對(duì)MM確診都有檢測(cè)意義，且均有明顯的lambda/Kappa輕鏈限制性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率一致，有助于鑒別診斷。

流式細(xì)胞檢查和免疫組化在診斷MM方面就靈敏度而言高于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)檢測(cè)，但不能評(píng)判骨髓增生程度及腫瘤浸潤(rùn)程度，而且國(guó)內(nèi)外少見這兩種方法對(duì)MM的診斷標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果存在差異?？筛鶕?jù)患者具體情況，采用三者聯(lián)合以提高陽(yáng)性診斷率及療效監(jiān)測(cè)。期待在不久的將來流式細(xì)胞檢查技術(shù)和免疫組化可以納入MM常規(guī)診斷和評(píng)估中。

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Application of 3 kinds of experimental techniques in detection of multiple myeloma

LUHan1,WANGZhi-yin2,LIQiang2△

(1.XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453000,China；2.FirstAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalCollege,Xinxiang,Henan453100,China.)

Objective To assess the clinical value of morphology，immunohistochemistry and flow cytometry detection techniques in the diagnosis of multiple myeloma(MM).Methods 30 cases of MM in the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College from September 2013 to May 2014 were collected for this study.The immunohistochemistry and flow cytometry were adopted to analyze the immunophenotyping of MM cells for investigating the relationship between the expression rates and MM cells morphological characteristics with the related detection indicators.Results In the morphology examination,the proportion of myeloma cells was 6.00%-95.00%,which by using immunohistochemistry was 9.00%-88.00% and which by using flow cytometry was 4.07%-87.42%.There were statistical differences between the morphology and immunohistochemistry and between the morphology and flow cytometry(P<0.05),but there was no statistical difference between immunohistochemistry and flow cytometry(P>0.05).Conclusion The combination of flow cytometry,immunohistochemistry and morphology even more conduces to the diagnosis and prognosis judgment of MM.

multiple myeloma； flow cytometry； immunohistochemistry； morphology； immunophenotype

蘆晗，女，在讀碩士，主要從事實(shí)驗(yàn)血液學(xué)研究?！?/p>

，E-mail：lq19600@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.09.039

A

1672-9455(2015)09-1278-03

2014-11-13

2015-01-17)