非那西丁和對乙酰氨基酚濃度評估肝臟儲備功能*

任 瑞，逯素梅，馬永梅，馬萬山(山東省千佛山醫(yī)院檢驗科，濟(jì)南 250014)

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非那西丁和對乙酰氨基酚濃度評估肝臟儲備功能*

任 瑞，逯素梅，馬永梅，馬萬山△(山東省千佛山醫(yī)院檢驗科，濟(jì)南 250014)

目的 對非那西丁和對乙酰氨基酚濃度分析進(jìn)行方法學(xué)研究，并進(jìn)行應(yīng)用性驗證，以評估肝臟儲備功能。方法 建立高效液相色譜法(HPLC)測定非那西丁與對乙酰氨基酚濃度，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線建立、精密度試驗及方法回收率試驗，并用健康人血漿進(jìn)行應(yīng)用性驗證。結(jié)果 非那西丁與對乙酰氨基酚在濃度為0.8～40.0 μg/mL的范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。在5、15、25 μg/mL樣品濃度下，非那西丁測定的日內(nèi)精密度分別為0.84%、1.09%和0.53%，日間精密度分別為1.51%、1.10%和1.38%；對乙酰氨基酚測定的日內(nèi)精密度分別為0.76%、0.89%和0.67%，日間精密度分別為1.02%、1.46%和1.21%，在濃度為1～20 μg/mL濃度范圍內(nèi)，利用所建立的分光光度技術(shù)測定，相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)小于10%，當(dāng)濃度超過5 μg/mL，RSD<5%。結(jié)論 HPLC簡便快捷、靈敏度和準(zhǔn)確度高，為評估肝臟儲備功能提供了一種快捷、準(zhǔn)確的方法。

高效液相色譜法； 非那西??； 對乙酰氨基酚； 肝臟儲備功能

肝臟儲備功能檢測對肝臟類疾病(如肝炎、肝硬化等)的判斷極為敏感和重要，但目前肝臟儲備功能評價技術(shù)和指標(biāo)如吲哚靛氰綠(ICG)清除試驗、影像學(xué)檢查、13C-美沙西汀呼氣試驗等存在諸多不足，因此臨床迫切需要建立靈敏度高、特異性強(qiáng)的肝臟儲備功能評價體系[1]。其中利用探針?biāo)幬餃y定肝臟藥物代謝酶細(xì)胞色素P450(CYP)的活性評價肝臟儲備功能備受重視[2]。CYP是生物體內(nèi)主要的代謝酶，存在種屬差異，可參與外源性(藥物、前毒物、前致癌物等)及內(nèi)源性物質(zhì)(膽固醇、脂肪酸等)的生物轉(zhuǎn)化，其同工酶CYP1A2是CYP酶系的重要家族之一，在人的肝臟呈組成型表達(dá)，可參與許多藥物、毒物和自身活性物質(zhì)的代謝，是臨床評價肝臟儲備功能的理想靶點[3-8]。研究表明，非那西丁是CYP1A2酶活性的特異性底物，在肝臟經(jīng)O-脫乙基化生成對乙酰氨基酚(圖1)[9-10]。通過測定血液中非那西丁及對乙酰氨基酚濃度用以反映CYP1A2活性及藥物之間的相互作用，是臨床評價CYP1A2 活性的理想方法[11-12]。本研究建立的方法簡便快捷、靈敏度和準(zhǔn)確度高，為非那西丁試驗研究肝臟CYP1A2 在體內(nèi)的藥物代謝活性提供了一種準(zhǔn)確、快捷的方式。

圖1 非那西丁在肝臟的O-脫乙基反應(yīng)

1 資料與方法

1.1 一般資料 健康成年人新鮮外周血。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 非那西丁(AR，Sigma公司)；對乙酰氨基酚(AR，Sigma公司)；高錳酸鉀(AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)；重鉻酸鉀(AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)；甲醇(色譜純，Merk公司)。

1.2.2 儀器 Alliance 2695型高效液相色譜儀(2998UV檢測器)(美國Waters公司)；Pico型微量臺式離心機(jī)(美國Thermo Fisher Scientific 公司)；Stratos高速離心機(jī)(美國Thermo Fisher Scientific 公司)；TW12型恒溫水浴槽(德國Julabo公司)；Xbridge C18色譜柱(美國Waters公司)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.3.1 非那西丁標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取非那西丁對照品80.0 mg，移入100 mL容量瓶中，用甲醇∶水(45∶55)溶解并稀釋至刻度,濃度為0.8 mg/mL，置于冰箱中保存。

1.3.2 對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取對乙酰氨基酚對照品80.0 mg，移入100 mL容量瓶中，用甲醇∶水(45∶55)溶解并稀釋至刻度，濃度為0.8 mg/mL，置于冰箱中保存。

1.3.3 色譜條件 分析柱是Waters Xbridge C18色譜柱(250 mm×416 mm,5 μm)；流動相為甲醇∶水(45∶55)；流速為1.0 mL/min；紫外檢測波長254 nm；柱溫為室溫；靈敏度是0102AU FS。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 按照上述色譜條件分別分析非那西丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.8 mg/mL)和對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.8 mg/mL)，結(jié)果表明2份組分在流動相為甲醇∶水(45∶55)條件下能得到完全分離。準(zhǔn)確取非那西丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.8 mg/mL)和對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.8 mg/mL)各5 mL,混合，移入100 mL容量瓶中并定容，所得溶液非那西丁和對乙酰氨基酚濃度均為40 μg/mL，然后依次配制32、24、16、8、7.2、6.4、5.6、4.8、4.0、3.2、2.4、1.6、0.8 μg/mL系列濃度的溶液，利用自動進(jìn)樣器依次進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μL，采集譜圖，記錄保留時間。分別以對非那西丁和對乙酰氨基酚的峰高對相應(yīng)濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。

1.3.5 精密度試驗 按上述方法配制含非那西丁和對乙酰氨基酚濃度為5、15、25 μg/mL的樣品，分別按樣品濃度測定方法測定日內(nèi)、日間精密度。

1.3.6 方法回收率試驗 取健康人血漿，配制不同濃度的非那西丁和對乙酰氨基酚混合溶液，測定濃度與實際濃度之比即為方法回收率。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 采用高效液相色譜法(HPLC)分析，圖2所示，非那西丁與對乙酰氨基酚得到很好的分離，二者保留時間分別為7.67 min和3.03 min。采集系列不同濃度下非那西丁的HPLC色譜圖，記錄保留時間和峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)做非那西丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，回歸方程為：峰面積=36 816×(濃度)-36 146(r=0.999 9)。進(jìn)樣量10 μL情況下，在濃度為0.8～40.0 μg/mL范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)品在不同濃度下標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)，回歸方程為：峰面積=36 352×(濃度)-34 785(r=0.999 9)。進(jìn)樣量10 μL情況下，在濃度0.8～40.0 μg/mL范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖2 非那西丁與對乙酰氨基酚HPLC色譜圖

圖3 非那西丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度-HPLC峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 對乙酰氨基酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度-HPLC峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 精密度試驗 按上述方法配制含非那西丁和對乙酰氨基酚濃度為5、15、25 μg/mL的樣品，分別按樣品濃度測定方法測定日內(nèi)、日間精密度，結(jié)果見表1。

表1 非那西丁、對乙酰氨基酚精密度試驗結(jié)果(%,n=6)

2.3 方法回收率試驗 取健康人血漿，配制不同濃度的非那西丁和對乙酰氨基酚混合溶液，利用建立的HPLC測定回收率見表2。在濃度為1～20 μg/mL范圍內(nèi)利用所建立的HPLC進(jìn)行測定，精密度均小5.00%，測定準(zhǔn)確，重復(fù)性好。

表2 HPLC技術(shù)測定回收率

注：PHN為對氨基苯乙醚，PRL為對氨基苯酚。

3 討 論

非那西丁在CYP1A2酶催化下經(jīng)O-脫乙基化生成對乙酰氨基酚，通過測定血液中非那西丁及對乙酰氨基酚濃度可評估肝臟儲備功能狀態(tài)。CYP1A2酶是各種因素導(dǎo)致肝臟疾病的共同易損靶點，因此，其特異性底物非那西丁是臨床評估肝臟儲備功能的一種理想探針?biāo)幬颷13]。非那西丁有本身肝外代謝極少；檢測終產(chǎn)物體現(xiàn)了生物轉(zhuǎn)化的連續(xù)性；受胃腸吸收、腎臟排泄功能的影響小；對人體影響小、測定簡便、價格低廉等優(yōu)點[14]。

一般而言，服用安全劑量范圍內(nèi)的非那西丁一定時間后，受藥物生物利用度和稀釋效應(yīng)等因素的影響，血液中的非那西丁和對乙酰氨基酚濃度均為微克級，需借助HPLC、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等現(xiàn)代儀器分析技術(shù)才能準(zhǔn)確測定血液中藥物及代謝產(chǎn)物水平與比值。

本研究建立HPLC測定非那西丁和對乙酰氨基酚濃度用于肝臟儲備功能的評估，避免了雜質(zhì)的干擾，縮短了分析時間，提高了靈敏度和特異度。HPLC作為一種高效、快速的分離、分析技術(shù)，以其靈敏度高、選擇性好，可分析微量組成甚至衡量樣品等特點，成為醫(yī)藥分析領(lǐng)域應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的現(xiàn)代分析技術(shù)之一[15]。

采用HPLC測定，非那西丁和對乙酰氨基酚能夠得到良好的分離度和線性關(guān)系，且簡便快捷、靈敏度和準(zhǔn)確度高，為研究CYP1A2在體內(nèi)的藥物代謝活性、評估肝臟儲備功能提供了一種快捷、準(zhǔn)確的方法。

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Concentrations of phenacetin and paracetamol for assessing liver reserve function*

RENRui,LUSu-mei,MAYong-mei,MAWan-shan△

(DepartmentofClinicalLaboratory,QianfoshanHospital,Jinan,Shandong250014,China)

Objective To perform the methodological study on detecting the levels of phenacetin and paracetamol and to conduct the application verification for assessing the liver reserve function.Methods The high performance liquid chromatography (HPLC) method for detecting the levels of phenacetin and paracetamol was established.The standard curve was established.The precision and recovery tests were performed and the healthy plasma was adopted for conducting the application verification.Results Both phenacetin and paracetamol showed a good linear relationship in the concentration range of 0.8-40 μg/mL.The within-day precisions of phenacetin under 5,15,25 μg/mL samples were 0.84%,1.09% and 0.53% respectively,which of paracetamol were 0.76%,0.89% and 0.67%,respectively.The inter-day precisions of phenacetin under 5,15,25 μg/mL samples were1.51%,1.10% and 1.38%,which of paracetamol were 1.02%,1.46% and 1.21%,respectively.RSD based on established spectrophotometric techniques is less than 10% in the range of 1-20 μg/mL Further,It is less than 5% when the concentration is more than 5 μg/mL.Conclusion The HPLC method is simple,fast,highly sensitive and highly accurate.It provides a fast and accurate method for assessing the liver reserve function.

HPLC method; phenacetin; paracetamol; liver reserve function

山東省科技攻關(guān)項目(2009GG10002005)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科研項目(2007HW116)。

任瑞，女，本科，在讀碩士，主要從事臨床檢驗診斷學(xué)。

△通訊作者，E-mail：mwsqianyi@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.09.011

A

1672-9455(2015)09-1205-03

2014-11-19

2015-01-19)