CD4＋CD25＋FOXP3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和PD－1＋CD4＋T細(xì)胞對(duì)宮頸內(nèi)皮細(xì)胞瘤預(yù)后的作用

李秀玉，胡 波，李忠新

（1．深圳市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳518000；2．中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州510630）

宮頸皮內(nèi)細(xì)胞瘤（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是一組宮頸病變的統(tǒng)稱，包括宮頸不典型增生和原位癌，為宮頸浸潤(rùn)癌的癌前期病變。病理上通常將CIN分為3級(jí)，CINⅠ級(jí)指輕度不典型增生，CINⅡ級(jí)指中度不典型增生，CINⅢ級(jí)指重度不典型增生及原位癌［1－2］。其主要病因是人乳頭瘤狀病毒（HPV）的感染，但70%以上HPV感染并不導(dǎo)致宮頸損害。可能原因包括招募調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）、髓樣來(lái)源的抑制細(xì)胞（myeloid－derived suppressor cells，MDSCs）和抑制性細(xì)胞因子的局部分泌，如IL－10、TGF－β，導(dǎo)致免疫效應(yīng)細(xì)胞的鈍化或失活。此外，體內(nèi)T細(xì)胞被激活后誘導(dǎo)產(chǎn)生抑制性受體如PD－1、CTLA－4，這些抑制性受體被稱為免疫檢查點(diǎn)（immune checkpoint）。它們?cè)谡Ｉ項(xiàng)l件下能保護(hù)機(jī)體免受免疫損傷或?qū)ψ陨砜乖褪堋Ｔ诼圆《拘愿腥净蚰[瘤患者體內(nèi)存在T細(xì)胞功能耗損，主要是因?yàn)镻D－1表達(dá)增多［3－5］。本研究觀察宮頸局部的CD4＋CD25＋FOXP3＋Tregs和PD－1＋CD4＋T細(xì)胞在CIN轉(zhuǎn)歸中的作用，為了解CIN的病理和預(yù)后提供依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 主要試劑與材料 RPMI－1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物公司，兩性霉素B、肝素購(gòu)自Sigma公司，F(xiàn)ITC－anti－PD－1、PC5．5－anti－CD4、APC－anti－CD25 購(gòu) 自 Santa Cruz公司，40%Percoll液購(gòu)自達(dá)科為生物公司；全新貝克曼CytoFLEX流式細(xì)胞儀。

1．2 方法

1．2．1 宮頸細(xì)胞樣品的收集 細(xì)胞刷收集36例病理診斷為CIN患者的宮頸細(xì)胞樣品。本研究得到了本院倫理委員會(huì)同意，所有患者均簽署知情同意書(shū)。病例排除有癥狀的陰道炎或性病。36例CIN患者被分為宮頸細(xì)胞學(xué)檢查消退的CIN患者和未消退的患者。在本研究中，細(xì)胞學(xué)上的消退被定義為連續(xù)2次間隔3～4個(gè)月檢測(cè)細(xì)胞學(xué)病理正常。其中18名患者為消退組，平均隨訪時(shí)間為16．5個(gè)月。另外18名為未消退組，作為對(duì)照，平均隨訪時(shí)間為19．0個(gè)月。收集每個(gè)患者的吸煙史和月經(jīng)情況。

1．2．2 宮頸淋巴細(xì)胞的收集和處理 按照文獻(xiàn)［6］用Digene細(xì)胞刷收集細(xì)胞。細(xì)胞刷插進(jìn)宮頸，旋轉(zhuǎn)幾次。把細(xì)胞刷立即放入裝入RPMI－1640培養(yǎng)基中［含10%胎牛血清、100mg／mL和2．5μg／mL 兩性霉素 B、抗凝 劑 （0．1IU／mL 肝素 和 8 nmol／L EDTA）］的試管中。把樣品放進(jìn)含5mmol／L DL－二硫蘇糖醇中在37℃震動(dòng)孵育15min，取出細(xì)胞刷。試管以330×g離心4min。然后用40%Percoll液10mL重懸細(xì)胞?；旌衔镉?0%Percoll液分層，480×g離心18min。單個(gè)核細(xì)胞分布在Percoll界面，吸取這些細(xì)胞，用PBS洗滌。細(xì)胞活性大于95%，新鮮的樣品立即用于后續(xù)的分析。

1．2．3 免疫標(biāo)記和流式細(xì)胞儀分析 采用熒光標(biāo)記的抗體檢測(cè)宮頸淋巴細(xì)胞表面抗原，包括 FITC－anti－PD－1，PC5．5－anti－CD4，APC－anti－CD25（Santa Cruz公司）。與抗體孵育后，細(xì)胞用 FACS 緩 沖 液 （10%FCS，1mmol／L EDTA，10mmol／L NaN3）洗2次，F(xiàn)OXP3固定／滲透工作液滲透，抗細(xì)胞內(nèi)抗原抗體免疫PE－anti－Foxp3標(biāo)記，流式細(xì)胞染色緩沖液沖洗細(xì)胞2次，用流式細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，同型抗體作為對(duì)照。每個(gè)樣品至少分析5 000個(gè)宮頸淋巴細(xì)胞，用流式細(xì)胞分析軟件分析。

1．2．4 HPV基因分型 HPV的基因分型委托金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心（廣州）完成，在本研究中24名患者的病毒學(xué)檢查見(jiàn)表1。根據(jù)國(guó)際癌癥研究署 HPVs 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、68、73、82被定義為高危型 HPV。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究采用JMP?軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用x±s表示，Wilcoxon rank sum tests或Fisher′s檢驗(yàn)用于配對(duì)比較分析。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 在CIN皮損處分離宮頸耐受T細(xì)胞亞群 宮頸淋巴細(xì)胞從位于Percoll和培養(yǎng)基中間相分離得到［3］。CD4＋CD25＋FOXP3＋Tregs或PD－1＋CD4＋T細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀分析（圖1）。宮頸CD4＋CD25＋FOXP3＋占14．2%，而 PD－1＋CD4＋T細(xì)胞占33．6%。在所有的CIN患者中，CD4＋CD25＋FOXP3＋Tregs的均值為11．8% （IQR：7．2～14．6，n＝36），而 PD－1＋CD4＋T細(xì)胞的比例為30．3% （IQR：20．2～38．4，n＝36）。

2．2 HPV基因型分布 36例中有6人多重感染；結(jié)果表明在宮頸內(nèi)皮細(xì)胞瘤中HPV感染的基因型主要以HPV16，HPV52，HPV58和HPV45多見(jiàn)。見(jiàn)表1。2．3 CD4＋CD25＋FOXP3＋Tregs和 PD－1＋CD4＋T 細(xì)胞和CIN之間的關(guān)系 所有患者在登記時(shí)被診斷CINⅠ、Ⅱ，隨后每4個(gè)月用陰道鏡和宮頸細(xì)胞涂片檢查隨訪，比較位于CIN消退和未消退（各18名）皮損處的CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs和PD－1＋CD4＋T細(xì)胞群，以確定是否宮頸耐受性T細(xì)胞亞群和CIN消退之間的相關(guān)性。18名CIN消退患者，平均持續(xù)時(shí)間為16．5（8～33）月。18名未消退患者持續(xù)性細(xì)胞學(xué)異常。消退組與未消退組高危型 HPV感染的檢出率（58．3%vs．83．3%，P＝0．37），CINⅡ的百分率（33．6%vs．58．2%，P＝0．40）和平均年齡（32歲vs．38歲，P＝0．44）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在消退組，宮頸CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs平均為7．3%（IQR：6．3～11．4），而未消退組宮頸 CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs平均為13．9% （IQR：11．6～16．9），前者顯著低于后者（P＝0．001 2）。消退組宮頸PD1＋CD4＋T細(xì)胞平均為20．8%（IQR：15．8～31．9），而未消退組宮頸PD1＋CD4＋T細(xì)胞平均為35．1% （IQR：30．2～42．6），前者顯著低于后者 （P＝0．017）。1例CIN患者宮頸皮損處分離的免疫細(xì)胞流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 患者感染HPV基因型的人數(shù)（n）

圖1 1例CIN患者宮頸皮損處分離的免疫細(xì)胞流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果

3 討 論

CIN是宮頸癌的癌前病理?yè)p傷，與HPV感染密切相關(guān)。但70%以上的HPV感染者是一過(guò)性感染，僅少數(shù)發(fā)展成CIN，最后進(jìn)展成宮頸癌。這表明除了HPV感染因素外，其他因素特別是宿主的免疫反應(yīng)在宮頸癌的進(jìn)展中也起重要作用。盡管一些研究報(bào)道抑制性淋巴細(xì)胞和腫瘤預(yù)后差成正相關(guān)，在腫瘤組織內(nèi)CD4＋CD25＋FOXP3＋Tregs的表達(dá)增加和PD－1＋CD4＋T細(xì)胞的增加常常表明預(yù)后較差，用PD－1單克隆抗體可以阻斷PD－1的信號(hào)途徑治療腫瘤。但是CD4＋CD25＋FOXP3＋Tregs和PD－1＋CD4＋T細(xì)胞在 HPV－感染相關(guān)的宮頸前期損傷的資料不多。本研究結(jié)果顯示位于宮頸前期損傷部位的 CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs和PD1＋CD4＋T細(xì)胞與CIN的自發(fā)消退呈負(fù)相關(guān)。

外周血CD4＋CD25＋FOXP3＋Tregs包括天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（nTregs）和誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（iTregs）。iTregs在黏膜耐受、對(duì)嚴(yán)重的慢性過(guò)敏性炎癥以及微生物的預(yù)防和腫瘤的監(jiān)視方面起關(guān)鍵作用，而nTregs則在阻止自身免疫和加重免疫反應(yīng)方面起重要作用［7－9］。在本研究中，作者預(yù)測(cè)宮頸CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs多數(shù)是iTregs。因?yàn)槿狈线m的表面標(biāo)記區(qū)分iTregs和nTregs細(xì)胞群，導(dǎo)致分離iTregs困難。

本研究結(jié)果還顯示宮頸皮損處CD4＋CD25＋FOXP3＋Tregs與CIN的消退成負(fù)相關(guān)，但與CIN的分級(jí)沒(méi)有明顯相關(guān)性（資料沒(méi)有顯示）。宮頸iTregs和循環(huán)的Tregs的TCR庫(kù)可能不同。已知iTregs通過(guò)黏膜相關(guān)的DC分泌TGF－β，從而導(dǎo)致成熟的處女CD4＋細(xì)胞分化成iTregs。整個(gè)宮頸淋巴細(xì)胞的CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs的比例（平均11%）是外周血（約5%）的2倍。這表明iTregs可能以抗原－依賴的方式連續(xù)產(chǎn)生，于是在慢性HPV感染的組織和CIN皮損處累積。有報(bào)道稱在宮頸樣品中，包括已脫落的上皮細(xì)胞和宮頸淋巴細(xì)胞在高級(jí)別鱗狀內(nèi)皮損傷（HSIL）患者較低級(jí)別的鱗狀上皮損傷（LSIL）中 的 FOXP3mRNA 高［10］。 但 是，F(xiàn)OXP3mRNA 與Tregs的數(shù)量平行仍不清楚，因?yàn)閷m頸淋巴細(xì)胞非特異性分離。據(jù)報(bào)道CD4＋CD25＋Treg的頻率與HPV16感染的持續(xù)性相關(guān)［11－12］。但在本研究中，作者無(wú)法了解CIN患者HPV的感染時(shí)間。此外Treg可能抑制免疫細(xì)胞清除HPV感染的細(xì)胞。

TGF－β對(duì)誘導(dǎo)和維持CD4＋CD25＋FOXP3＋Treg非常關(guān)鍵，特別是在處女CD4＋細(xì)胞向iTregs的誘導(dǎo)和效應(yīng)T細(xì)胞向iTregs的轉(zhuǎn)化中很重要。幾個(gè)研究已經(jīng)證明了在宮頸樣本中TGF－β和維甲酸（RA）受體的表達(dá)在 CIN 皮損處降低［13－15］。在這些研究中，TGF－βmRNA水平與CIN分級(jí)或CIN的自然病程不相關(guān)。TGF－β誘導(dǎo)的iTregs水平較TGF－β更直接指示CIN進(jìn)展。事實(shí)上，在CIN皮損處檢測(cè)抑制性T細(xì)胞水平可以判斷預(yù)后。

在本研究中，作者主要研究PD－1＋CD4＋T細(xì)胞和CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs，因?yàn)門細(xì)胞的PD－1對(duì)于處女CD4＋細(xì)胞分化成CD4＋CD25＋Foxp3＋iTregs非常關(guān)鍵。而且，Tregs和PD－1／PD－L途徑的整合決定免疫反應(yīng)的終止和提高對(duì)抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)的抑制。PD－1途徑控制黏膜部位iTregs的發(fā)育、維持和功能。本研究結(jié)果顯示PD－1＋CD4＋T細(xì)胞在宮頸淋巴細(xì)胞較外周血多，CIN皮損處的PD1＋CD4＋T細(xì)胞的比例與CIN自發(fā)消退成負(fù)相關(guān)。至于其他耐受性T細(xì)胞亞群因受到獲取的淋巴細(xì)胞數(shù)量的限制而未被研究。

作者的研究存在一定的局限性，主要是標(biāo)本量少，只有36個(gè)病例，HPV感染的類型多，且有多個(gè)型別的HPV感染，獲取宮頸淋巴細(xì)胞數(shù)量受限。但作者的流式細(xì)胞儀分析證明了CD4＋CD25＋Foxp3＋Tregs侵潤(rùn)至CIN皮損處，與CIN的消退顯著相關(guān)，與感染的HPV亞型無(wú)關(guān)。相反地，皮損處宮頸CD4＋CD25＋FOXP3＋Tregs的高發(fā)生率可能負(fù)責(zé)CIN的持續(xù)性，可作為CIN進(jìn)展的標(biāo)記物。

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