海南產(chǎn)紅樹(shù)植物老鼠簕中2—苯并唑啉酮分離鑒定及含量測(cè)定

張宏武等

[摘要] 目的 分離制備海南產(chǎn)紅樹(shù)植物老鼠簕中指標(biāo)性成分并建立其含量測(cè)定方法。 方法 選擇老鼠簕高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器（HPLC-DAD）色譜中的主要成分作為其指標(biāo)性成分進(jìn)行分離鑒定，并應(yīng)用HPLC建立其含量測(cè)定方法，色譜條件為：Shiseido（Pak-C18）色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相：乙腈-水（35∶65）。流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm，柱溫：30℃。結(jié)果 從老鼠簕中分離鑒定了1個(gè)生物堿成分2-苯并唑啉酮，并建立了HPLC含量測(cè)定方法，在0.004 32～1.08 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r = 0.9999，n = 5）。平均回收率（n = 9）為97.54%。結(jié)論 本方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，可用于海南產(chǎn)老鼠簕藥材中2-苯并唑啉酮的含量測(cè)定。

[關(guān)鍵詞] 老鼠簕；生物堿；高效液相色譜法

[中圖分類號(hào)] R284 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）02（b）-0106-04

[Abstract] Objective To reporte the isolation of 2-Benzoxzololinone alkaloid from the roots of Acanthus ilicifolius L. and establish a HPLC method to determine the content of the 2-Benzoxzololinone alkaloid in the root of Mangrove Acanthus ilicifolius L. from Hainan Province. Methods A Shiseido （Pak-C18） （5 μm， 4.6 mm×150 mm） column was used with a mobile phase of acetonitrile-water （35∶65）. The flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was setted at 30℃. The detection wavelength was 270 nm. Results The linear range of 2-Benzoxzolol was 0.004 32～1.08 mg/mL （r = 0.9999， n = 5） and the average recovery （n = 9） was 97.54%. Conclusion The method is accurate， simple， reproducible， and can be used to determine the content of 2-Benzoxzololinone alkaloid in Acanthus ilicifolius L. from Hainan Province.

[Key words] Acanthus ilicifolius L.； Alkaloid； HPLC

紅樹(shù)植物（Mangrove plants）是熱帶、亞熱帶海區(qū)潮間帶特有的木本植物，我國(guó)利用紅樹(shù)植物作為藥用已有較長(zhǎng)的歷史，尤其是民間用藥。老鼠簕（Acanthus ilicifolius L.）為爵床科老鼠簕屬植物，又名老鼠怕、軟骨牡丹、蚧瓜等，其性寒，味淡，全株或根入藥，為紅樹(shù)林重要的藥用植物之一，與其他紅樹(shù)林植物共生于海灘及淺海中。全世界共有50種，其中屬于紅樹(shù)林的老鼠簕、小花老鼠簕（A. ebracteatus Vahl）和廈門老鼠簕（A. xianmensis Zhang）主要分布在我國(guó)廣西、廣東、海南、臺(tái)灣、福建和浙江南部沿海海岸[1]。民間廣泛用于治療急慢性肝炎、哮喘、風(fēng)濕病、麻痹癥、蛇傷等，有鎮(zhèn)痛和抗感染作用。在海南民間常用老鼠簕消腫、解毒、治療淋巴結(jié)腫大、急性肝脾疼痛、黃疸、胃痛和哮喘，將其根搗碎水煮，加上蜂蜜口服，是治療乙型肝炎的特效藥[2]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗肝纖維化[3]和抗氧化[4-5]、抗腫瘤[6]、抗菌[7]、抗感染鎮(zhèn)痛[8]、預(yù)防骨質(zhì)疏松[9]等作用。化學(xué)成分研究表明老鼠簕主要含有生物堿、黃酮類、皂苷、甾醇類化學(xué)成分[10-14]，其中生物堿類成分是其抗感染、止痛活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。有研究表明：老鼠簕中的2-苯并唑啉酮具有殺利什曼原蟲(chóng)的作用[15]。目前尚未見(jiàn)對(duì)海南產(chǎn)老鼠簕植物質(zhì)量控制的報(bào)道，為了開(kāi)發(fā)利用海南的紅樹(shù)植物資源，筆者首次對(duì)海南產(chǎn)紅樹(shù)植物老鼠簕藥材的質(zhì)量做了進(jìn)一步的評(píng)價(jià)，對(duì)老鼠簕中的指標(biāo)性成分——2-苯并唑啉酮，進(jìn)行了分離制備和結(jié)構(gòu)測(cè)定，并首次對(duì)其海南產(chǎn)8批老鼠簕藥材中2-苯并唑啉酮含量進(jìn)行了測(cè)定。該方法可靠、靈敏、重復(fù)性好，可以很好地控制藥材的質(zhì)量，為海南產(chǎn)老鼠簕藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供了參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

儀器Fisher-Johns熔點(diǎn)儀（溫度未校正）；BrukerAM600核磁共振波譜儀（TMS做內(nèi)標(biāo)）；996-2487高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）：600泵；PDA紫外可見(jiàn)檢測(cè)器；empower工作站，電子天平（MSA125P-100-DU，賽多利斯，德國(guó)）；超聲波清洗器（KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。柱色譜Sephadex LH-20為Pharmacia公司產(chǎn)品，薄層色譜及柱色譜用硅膠均為青島海洋化工廠產(chǎn)品。

試劑：色譜乙腈（Burdick & Jackon，美國(guó)）；娃哈哈純凈水；其余試劑均為北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

樣品：8批海南產(chǎn)老鼠簕樣品分別于2008、2009年采自海南文昌、瓊山地區(qū)，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院海南分所助理研究員李榕濤鑒定為爵床科老鼠簕屬植物Acanthus ilicifolius L.的根。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取與分離

取老鼠簕藥材1 kg，粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，用95%乙醇回流提取2次，每次2 h，提取液減壓回收溶劑至無(wú)醇味，得浸膏115 g，將115 g浸膏加適量水混懸后，用8倍量乙酸乙酯萃取3次。合并萃取液，并減壓濃縮，得到乙酸乙酯部分5 g。將乙酸乙酯部分反復(fù)經(jīng)硅膠（100～200目）柱色譜分離，用二氯甲烷-甲醇（100∶0～0∶100）系統(tǒng)梯度洗脫，并經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離，用二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到化合物32.8 mg，經(jīng)NMR鑒定為2-苯并唑啉酮。

2.2 2-苯并口惡唑啉酮對(duì)照品核磁數(shù)據(jù)

3 討論

3.1 對(duì)照品的選擇

有研究表明，2-苯并唑啉酮對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制作用，并有鎮(zhèn)靜、降溫、抗驚厥、催眠，肌松弛及抗真菌作用，其對(duì)利什曼原蟲(chóng)的LD50為40 μg/mL[15]。是老鼠簕藥材中指標(biāo)性成分，因此2-苯并唑啉酮的含量可以來(lái)評(píng)價(jià)老鼠簕藥材質(zhì)量。

3.2 提取方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)曾分別用二氯甲烷、95%乙醇和甲醇作為提取溶劑，超聲提取老鼠簕中2-苯并唑啉酮：提取2次，每次20 min，合并濾液，純甲醇定容于5 mL量瓶中，高效液相色譜（HPLC）測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇提取物中2-苯并唑啉酮最高。在確定提取溶劑后，又對(duì)甲醇超聲提取和回流提取方式及提取次數(shù)進(jìn)行了考察，結(jié)果表明：甲醇超聲提取和回流提取對(duì)老鼠簕中2-苯并唑啉酮的含量影響不大，考慮到超聲提取方法簡(jiǎn)便，易行，故選擇超聲提取方法，作為提取方法。對(duì)提取時(shí)間的考察：分別提取10、20、45、60 min，10 min不能完全提取，20 min和45 min結(jié)果基本相同，而60 min的結(jié)果比45 min略低，故選擇提取20 min。所以最后確定提取方法為：甲醇超聲提取2次，每次20 min。

3.3流動(dòng)相的篩選

本試驗(yàn)對(duì)甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水這三種流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了篩選比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-水系統(tǒng)和甲醇-0.1%甲酸水系統(tǒng)存在色譜峰拖尾的現(xiàn)象，而換用乙腈-水系統(tǒng)即可得到滿意的色譜峰形，同時(shí)與其他雜質(zhì)峰的分離度也很高。故選擇乙腈-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相，并調(diào)節(jié)流動(dòng)相，最終選擇乙腈-水（35∶65）作為洗脫溶劑，老鼠簕藥材中2-苯并唑啉酮與其他組分得到較好的分離，且峰形對(duì)稱，出峰時(shí)間適宜，適合作為老鼠簕藥材中2-苯并唑啉酮含量測(cè)定用流動(dòng)相。

3.4耐用性的考察

本實(shí)驗(yàn)換用Agilent（SB-C18）色譜柱（5 μm，4.6 mm× 250 mm），用適當(dāng)乙腈和水等度洗脫，2-苯并唑啉酮也達(dá)到基線分離，結(jié)果表明該方法耐用性較好。

3.5 柱溫和檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本實(shí)驗(yàn)采用30℃柱溫，可以減少流動(dòng)相黏度、降低柱壓并改善分離效果，同時(shí)降低環(huán)境對(duì)分離的影響程度，故將柱溫定為30℃。用二極管陣列檢測(cè)器在波長(zhǎng)190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，通過(guò)觀察2-苯并唑啉酮的紫外圖譜，發(fā)現(xiàn)2-苯并唑啉酮在270 nm左右處有最大吸收，并且在270 nm處測(cè)定基線波動(dòng)小，峰形理想，樣品中其他組分干擾小，所以選擇270 nm作為HPLC的檢測(cè)波長(zhǎng)。

本方法直接進(jìn)樣，不需要進(jìn)行前處理，雜質(zhì)峰與樣品峰能達(dá)到基線分離，且在該色譜條件下2-苯并唑啉酮對(duì)照品峰形均勻?qū)ΨQ，證明本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速，重復(fù)性好，且該方法的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、精密度、回收率試驗(yàn)均均能滿足定量的要求，且專屬性好，故可以用于海南產(chǎn)紅樹(shù)植物老鼠簕中2-苯并唑啉酮的含量測(cè)定。

3.6 樣品測(cè)定結(jié)果

從海南不同產(chǎn)地的8批老鼠簕藥材中2-苯并唑啉酮含量測(cè)定的結(jié)果來(lái)看，8批老鼠簕藥材中2-苯并 唑啉酮含量差異比較大，因此有必要對(duì)老鼠簕藥材的采集、種植做進(jìn)一步的系統(tǒng)研究及規(guī)范，從而保證老鼠簕藥材質(zhì)量的穩(wěn)定性。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 林鵬.中國(guó)紅樹(shù)林環(huán)境生態(tài)及經(jīng)濟(jì)利用[M].北京：高等教育出版社，1995：19.

[2] 華南植物研究所.南海植物志[M].2卷.北京：科學(xué)出版社，1974：180.

[3] 梅燕，候軟玲，劉琳，等.老鼠簕乙醇提取物對(duì)肝纖維化大鼠COX-2和TGFβ1表達(dá)的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23（4）：888-890.

[4] 胡忠，吳奕瑞，黎寶榮，等.老鼠簕類黃酮的提取及生理活性研究[J].汕頭大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，22（3）：49-54.

[5] Babu BH，Shylesh BS，Padikkala J. Antioxidant and hepatoprotective effect of Acanthus ilicifolius [J]. Fitoterapia，2001，72：272-277.

[6] Babu BH，Shylesh BS，Padikkala J. Tumour reducing and anticarcinogenic activity of Acanthus ilicifolius in mice [J]. Journal of Ethnopharmacology，2002，79：27-33.

[7] Ravikumar S，Raja M，Gnanadesigan M. Antibacterial potential of benzoate and Phenylethanoid derivatives isolated from Acanthus ilicifolius L. leaf extracts [J]. Nat Prod Res，2012，26（23）：2270-2273.

[8] 王宗英，陳永好，鄭廣進(jìn)，等.老鼠簕生物堿A及其衍生物乙酰老鼠簕生物堿A的抗炎鎮(zhèn)痛作用[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31（10）：807-810.

[9] Phan VK，Tran HQ，Tran TH，et al. Chemical constituents of Acanthus ilicifolius L. and effect on osteoblastic MC3T3E1 cell [J]. Archives of Pharmacal Research，2008，31（7）：823-829.

[10] Minocha PK，Tiwari KP. A triterpenoidal saponin from roots of Acanthus illicifolius [J]. Phytochemistry，1981，20：135-137.

[11] 彭興，龍盛京.老鼠簕的化學(xué)成分研究[J].中草藥，2006， 37（7）：971-973.

[12] 霍長(zhǎng)虹，趙玉英，梁紅，等.老鼠簕化學(xué)成分研究[J].中國(guó)中藥雜志，2005，30（10）：763-765.

[13] 劉泉，林文瀚.中國(guó)南海紅樹(shù)植物老鼠簕的化學(xué)成分研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，24（6）：648-651.

[14] 霍長(zhǎng)虹，王邠，梁紅，等.紅樹(shù)林植物老鼠簕化學(xué)成分研究[J].中國(guó)中藥雜志，2006，31（24）：2052-2054.

[15] Kapil A，Sharma S，Wahidulla S. Leishmanicidal activity of 2-Benzoxaolinone from Acanthus ilicifolius in vitro [J]. Planta Med，1994，60（2）：187-188.

（收稿日期：2014-10-31 本文編輯：衛(wèi) 軻）