大黃素對(duì)糖尿病大鼠腸平滑肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及調(diào)控機(jī)制的研究＊

諸 軍，馬 瑤，陳 婷，陳龍霞，楊倩穎，趙宏賢

（四川醫(yī)科大學(xué)：1.2010級(jí)臨床醫(yī)學(xué)2系；2.組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，四川瀘州646000）

糖尿病是一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病，大量的研究證實(shí)糖尿病患者存在腸道動(dòng)力下降。糖尿病引起腸道運(yùn)動(dòng)下降的具體機(jī)制不是很清楚，研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病可導(dǎo)致腸平滑肌細(xì)胞凋亡增加。細(xì)胞凋亡有3條途徑，其中死亡受體與線粒體途徑為經(jīng)典的凋亡途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）途徑是近年發(fā)現(xiàn)的第3條重要的細(xì)胞凋亡途徑，它在多種細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)，ERS引起細(xì)胞凋亡又有3條途徑：c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK），CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT／enhancerbinding protein homologous protein，CHOP）與Caspase-12激活途徑。其中Caspase-12激活是其核心途徑。大黃素是中藥大黃主要活性成分，現(xiàn)代研究已證實(shí)大黃素能夠明顯調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌運(yùn)動(dòng)，其具體機(jī)制有待深入研究。本實(shí)驗(yàn)建立糖尿病大鼠模型，并在觀察到腸動(dòng)力下降的基礎(chǔ)上，檢測(cè)ERS是否參與糖尿病腸平滑肌細(xì)胞凋亡，以及大黃素對(duì)其調(diào)控機(jī)制，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康純系雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量200g左右（瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科提供，許可證號(hào)：川實(shí)動(dòng)管質(zhì)第17號(hào)）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，美國(guó)Sigma公司）；大黃素（上海晶純有限公司）；TUNEL試劑盒（瑞典Roche Diagnostics公司）；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、Caspase-12多克隆抗體（美國(guó)Bioword公司）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病造模 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，選擇10只血糖正常者健康大鼠作為對(duì)照組，其余大鼠參考Long等[1]方法制作糖尿病模型，以血糖持續(xù)1周大于或等于16.9mmol／L為糖尿病造模成功（成模）。成模大鼠分為糖尿病組（10只）與大黃素組（10只）。成模2周后，對(duì)照組與糖尿病組以磷酸鹽緩沖液（PBS）5mL／kg灌胃，大黃素組用8g／L大黃素混懸液灌胃，5mL／kg每天1次，直至取材前1d（10周時(shí)）。（1）一般指標(biāo)：觀察進(jìn)食量、飲水量、尿量等，每周測(cè)體質(zhì)量1次，取材前（10周時(shí)）再測(cè)體質(zhì)量。（2）血糖測(cè)定：造模后第3天及成模后1、4和8周采尾血監(jiān)測(cè)空腹血糖，取材前（10周時(shí)）再測(cè)血糖1次。（3）腸動(dòng)力學(xué)指標(biāo)：各組大鼠禁食不禁水24h后，將1mg／mL的亞甲藍(lán)溶液0.4mL經(jīng)口灌胃，30min后處死大鼠，迅速游離小腸，測(cè)量小腸被美亞甲藍(lán)染成藍(lán)色的末端至幽門(mén)的距離（a）和小腸總長(zhǎng)度（A）即幽門(mén)至回盲瓣的距離，計(jì)算小腸推進(jìn)率＝a／A×100%。

1.2.2 TUNEL法檢測(cè)腸平滑肌細(xì)胞凋亡 按TUNEL試劑盒說(shuō)明的步驟進(jìn)行染色。染色樣品片放入3%H2O2水溶液中，室溫10min；PBS洗滌樣片，加TdT及Biotin-dUTP混合液至樣片20μL／片，37℃濕盒中孵育標(biāo)記60min；以封閉液按照1∶50配置辣根過(guò)氧化酶（HRP）為工作液，50μL加于樣品片，37℃盒中孵育標(biāo)記60min，二氮基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液顯色，蘇木素染液復(fù)染細(xì)胞核。TUNEL法陽(yáng)性結(jié)果判斷：細(xì)胞核棕黃（褐）色。每組取10個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本1張切片，數(shù)碼顯微鏡照相，Image-proplus5.0軟件計(jì)算各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腸平滑肌GRP78、Caspase-12蛋白表達(dá)取距回盲部10cm處回腸組織常規(guī)石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10min，蒸餾水沖洗3min×3次，微波抗原修復(fù)20min，正常羊血清封閉，室溫孵育15min，加1∶100一抗體4℃過(guò)夜，PBS洗片5min×3次，滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃，20min，PBS洗片5min×3次，加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（SABC）液，37℃，20min，PBS洗片5min×3次，DAB顯色，自來(lái)水沖洗，脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。每組取10個(gè)標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本2張切片。GRP78、Caspase-12陽(yáng)性結(jié)果判斷：細(xì)胞質(zhì)著色，染成棕黃（褐）色為陽(yáng)性。數(shù)碼顯微鏡照相，Image-proplus5.0軟件分析積分光密度（OD）值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般狀況及血糖水平比較 對(duì)照組一般狀況良好；糖尿病組與大黃素組于造模后第3天開(kāi)始出現(xiàn)多飲、多食、多尿，成模10周時(shí)，兩組大鼠精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、皮毛疏松無(wú)光澤、背部的毛發(fā)部分脫落，少數(shù)極度衰竭，體質(zhì)量明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。造模3d后，模型組與大黃素組空腹血糖始終維持在16.9mmol／L以上；成模10周時(shí)，與對(duì)照組比較，模型組與大黃素組大鼠血糖均顯著增加（P＜0.05），與模型組比較，大黃素組大鼠血糖顯著降低（P＜0.05），但未降至正常水平，見(jiàn)表1。

表1 大鼠體質(zhì)量與血糖水平比較（±s）

表1 大鼠體質(zhì)量與血糖水平比較（±s）

＊：P＜0.05，與對(duì)照組比較；＃：P＜0.05，與糖尿病組比較。

組別 n 體質(zhì)量（g）血糖水平（mmol／L）10 457.00±23.10 6.52±3.54糖尿病組 10 165.54±26.48＊ 27.49±5.26＊大黃素組 10 175.22±15.28＊ 20.33±7.28＊＃對(duì)照組

2.2 小腸推進(jìn)率 糖尿病組小腸推進(jìn)率明顯低于對(duì)照組（31.26%±8.25%vs.50.83%±7.54%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；大黃素組小腸推進(jìn)率明顯高于糖尿病組（40.23%±6.79%vs.31.26%±8.25%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 腸平滑肌細(xì)胞凋亡（TUNEL，×400）

圖2 腸平滑肌細(xì)胞GRP78蛋白陽(yáng)性表達(dá)（SABC，×200）

2.3 腸平滑肌細(xì)胞凋亡率 糖尿病組腸平滑肌細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組（11.65%±3.30%vs.2.54%±1.30%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；大黃素組腸平滑肌細(xì)胞凋亡率明顯低于糖尿病組（6.50%±1.97%vs.11.65%±3.30%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖3 腸平滑肌細(xì)胞Caspase-12蛋白陽(yáng)性表達(dá)（SABC，×200）

2.4 腸平滑肌細(xì)胞GRP78與Caspase-12蛋白表達(dá)情況 糖尿病組腸平滑肌細(xì)胞GRP78與Caspase-12蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；大黃素組腸平滑肌細(xì)胞GRP78與Caspase-12蛋白表達(dá)明顯低于糖尿病組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2，圖2、3。

表2 腸平滑肌細(xì)胞GRP78與Caspase-12蛋白OD值（±s）

表2 腸平滑肌細(xì)胞GRP78與Caspase-12蛋白OD值（±s）

＊：P＜0.05，與對(duì)照組比較；＃：P＜0.05，與糖尿病組比較。

組別 n GRP78 Caspase-12對(duì)照組10 8.87±1.781 23.68±7.24糖尿病組 10 17.08±3.81＊ 51.00±8.69＊大黃素組 10 12.42±1.90＊＃ 34.79±5.14＊＃

3 討論

近年來(lái)大量研究證實(shí)，糖尿病患者腸道存在運(yùn)動(dòng)障礙，而腸道平滑肌細(xì)胞凋亡可能在上述過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)顯示成模10周時(shí)，糖尿病大鼠小腸推進(jìn)率下降，表明存在腸道動(dòng)力下降癥狀，糖尿病大鼠腸平滑肌細(xì)胞凋亡增多，與相關(guān)研究結(jié)果一致。

ERS是指細(xì)胞受到環(huán)境毒物、缺氧、病毒、紫外線等刺激時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)的腔內(nèi)錯(cuò)誤折疊，未折疊蛋白聚集以及Ca2＋平衡紊亂的狀態(tài)。ERS可促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生一系列生理變化對(duì)蓄積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)進(jìn)行處理，從而有利于維持細(xì)胞的正常功能并使之存活，但是過(guò)度的ERS可引起細(xì)胞凋亡[2]。GRP78與熱休克蛋白70（Hsp70）家族具有高度同源性，被認(rèn)為是Hsp70家族成員之一[3]。GRP78為ERS標(biāo)志性蛋白[4-6]。ERS是引起糖尿病及慢性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制之一[7-8]。本研究顯示，糖尿病大鼠腸平滑肌細(xì)胞GRP78表達(dá)水平上調(diào)，表明糖尿病大鼠腸道平滑肌細(xì)胞存在ERS反應(yīng)。ERS介導(dǎo)的凋亡途徑中，Caspase-12起著至關(guān)重要的作用。Caspase-12只在大鼠和小鼠體內(nèi)被克隆。有研究認(rèn)為人的Caspase-4與鼠Caspase-12為同源物，Caspase-4在人體中發(fā)揮著鼠Caspase-12的作用[9]。Caspase-12的激活是ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的核心途徑，它可以激Caspase-9，后者則激活Caspase-3，最終引起細(xì)胞凋亡[10]。研究表明，Caspase-12與阿爾茲海默病、視網(wǎng)膜變性、呼吸系統(tǒng)感染疾病等多種疾病有關(guān)[11-13]。本實(shí)驗(yàn)表明，糖尿病大鼠腸道平滑肌細(xì)胞Caspase-12蛋白表達(dá)水平上調(diào)可能引起ERS介導(dǎo)的腸平滑肌細(xì)胞凋亡，引起有功能的細(xì)胞減少，進(jìn)而導(dǎo)致導(dǎo)致大鼠小腸動(dòng)力降低。研究表明，大黃素使便秘大鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢中的膽堿能神經(jīng)分布趨于正常，可能是其調(diào)節(jié)結(jié)腸功能、治療慢傳輸型便秘的機(jī)制之一[14]。大黃素屬蒽醌衍生物，是大黃等多種中藥的有效成分。是目前臨床上用于緩瀉的藥物如麻子仁丸、蓯蓉通便口服液、大黃通便膠囊、大黃便秘散等有效成分之一[15-16]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，大黃素具有諸多藥理作用。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，大黃素能夠明顯調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌運(yùn)動(dòng)。本研究表明，大黃素可提高糖尿病大鼠腸道動(dòng)力，其增強(qiáng)腸動(dòng)力的機(jī)制之一可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Caspase-12蛋白表達(dá)，減輕ERS介導(dǎo)的腸平滑肌細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還表明大黃素并未能將糖尿病大鼠腸動(dòng)力恢復(fù)至對(duì)照組水平，提示大黃素在使用過(guò)程中應(yīng)與其他藥物配合治療。

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