基因芯片聯(lián)合Sanger測序技術(shù)在非綜合征型聾患者基因診斷中的應(yīng)用△

伍麗東唐寧嚴提珍李哲濤李健鴻李伍高龐紅羅世強邱琪

1廣西壯族自治區(qū)聽力言語康復(fù)中心(南寧　530001) ; 2柳州市出生缺陷預(yù)防與控制重點實驗室;柳州市婦幼保健院檢驗科

基因芯片聯(lián)合Sanger測序技術(shù)在非綜合征型聾患者基因診斷中的應(yīng)用△

伍麗東1唐寧2嚴提珍2李哲濤2李健鴻1李伍高2龐紅1羅世強2邱琪1

1廣西壯族自治區(qū)聽力言語康復(fù)中心(南寧530001) ; 2柳州市出生缺陷預(yù)防與控制重點實驗室;柳州市婦幼保健院檢驗科

【摘要】目的應(yīng)用基因芯片聯(lián)合Sanger測序技術(shù)檢測廣西壯族自治區(qū)聽力言語康復(fù)中心非綜合征型聾患者的基因突變譜系及基因型，為基因診斷、遺傳咨詢及防聾治聾提供參考。方法對廣西壯族自治區(qū)聽力言語康復(fù)中心136例雙側(cè)重度及以上程度感音神經(jīng)性非綜合征型聾患兒采集外周血并提取基因組DNA，用遺傳性聾基因芯片對4個耳聾易感基因的9個突變位點(GJB2基因: c.35delG、c.235delC、c.176del16、c.299delAT; GJB3基因: c.538C＞T; SLC26A4基因: c.919-2A＞G、c.2168A＞G; mtDNA 12SrRNA基因: m.1494C＞T、m.1555A＞G)進行分析?；蛐酒夹g(shù)未確診的樣本采用Sanger測序法進一步檢測。結(jié)果通過基因芯片技術(shù)在20例聾兒中檢出GJB2、SLC26A4和線粒體12SrRNA基因突變，總檢出率為14.71% (20/136) ;結(jié)合Sanger測序技術(shù)，34例聾兒檢出GJB2、SLC26A4和12SrRNA基因突變，總檢出率為25%(34/136)，發(fā)現(xiàn)6種基因芯片技術(shù)未檢出的SLC26A4突變位點(c.259G＞T、c.754C＞T、c.1229C＞T、c.1548_1549insC、c.1705+ 5A＞G和c.2086C＞T)。GJB2基因以c.235delC突變?yōu)橹?，SLC26A4基因以c.919-2A＞G、c.754C＞T和c.1229C＞T為主; GJB2和SLC26A4基因突變者占本組病例基因突變總例數(shù)的38.24%(13/34)和58.82%(20/34)。結(jié)論基因芯片聯(lián)合Sanger測序技術(shù)可以提高非綜合征型聾患者基因突變的檢出率;廣西壯族自治區(qū)聽力言語康復(fù)中心非綜合征型聾患者熱點突變基因以GJB2和SLC26A4基因為常見。

【關(guān)鍵詞】非綜合征型聾;易感基因;基因芯片; Sanger測序

△國家自然科學基金項目(81360159)、廣西科技攻關(guān)項目(桂科攻14124004-1-20)、柳州市科技攻關(guān)項目(2014J030401)、柳州市科學研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目研究成果(2014G020404)聯(lián)合資助

2006年全國第二次殘疾人抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，全國聽力殘疾人共2 780萬，其中單純聽力殘疾人占2 004萬，多重殘疾人中伴有聽力殘疾的占776萬，聽力殘疾占全部殘疾的27%，并以每年3萬的速度增長［1］。耳聾的致病因素很復(fù)雜，如遺傳、感染、外傷、藥物應(yīng)用不當、生理機能退化、噪聲等，其中遺傳為主要因素，約占60%［2］，絕大部分的遺傳性聾為非綜合征型聾(nonsyndromic hearing loss，NSHL)。全國不同地區(qū)及不同人群中耳聾致病基因的流行病學調(diào)查顯示，GJB2、SLC26A4和線粒體基因是導(dǎo)致我國大部分非綜合征型聾的三個最常見的致病基因［3～5］，且不同基因在不同地區(qū)、不同民族的患者突變位點不同。

目前基因芯片技術(shù)是臨床常用的檢測方法，該技術(shù)具有簡便易行、成本較低、適于大規(guī)模篩查等優(yōu)點，但是其只針對常見的四個基因(GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體DNA 12SrRNA)九個突變位點進行檢測，無法檢測出這些基因少見或未知的突變，因檢測范圍的限制可導(dǎo)致部分聾兒被漏診。Sanger測序技術(shù)被視為診斷遺傳性聾基因突變的金標準方法，其準確性高，可提供檢測基因全面的序列信息，但成本高、耗時長、不適用于大規(guī)模篩查。因此，尋找一種能廣泛應(yīng)用的低成本、快速、有效的篩查策略非常必要。為了解基因芯片聯(lián)合Sanger測序技術(shù)應(yīng)用于非綜合征型聾基因突變篩查的可行性，本研究采用該兩種方法對廣西壯族自治區(qū)聽力言語康復(fù)中心NSHL患兒進行線粒體DNA12SrRNA、GJB2、GJB3和SLC26A4基因的突變分析，以了解其耳聾基因突變譜系，為該中心耳聾患者進行基因診斷、遺傳咨詢及防聾治聾提供參考。

1　資料與方法

1.1研究對象及樣本采集于2013年9月選取在廣西壯族自治區(qū)聽力言語康復(fù)中心進行康復(fù)訓練的無血緣關(guān)系的雙側(cè)重度及以上程度感音神經(jīng)性聾患者136例為研究對象，其中男81例，女55例，年齡1歲5個月～17歲; 10例有明確耳聾家族史。經(jīng)知情告知并簽署知情同意書后，采集所有患者的一般信息、出生史、耳聾發(fā)病年齡、家族史、個人史(耳聾前傳染病史、耳毒性藥物使用史、頭部外傷史等)、母孕產(chǎn)期情況等。對研究對象進行全身和專科檢查、頭部CT和MRI影像學檢查，以排除綜合征型聾，并由專業(yè)人員進行耳科常規(guī)檢查、純音測聽、聲導(dǎo)抗和聽性腦干反應(yīng)等檢查。抽取所有對象外周靜脈血3～5 ml(EDTA抗凝)備用。

1.2DNA提取和濃度測定利用試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取外周血基因組DNA，提取步驟參照試劑盒提供的使用說明進行。利用ND -1000-UV-VIS波長紫外/可見光掃描分光光度計(NanoDrop，美國)對樣本的基因組DNA的提取質(zhì)量和濃度進行檢測。DNA樣本的OD260nm/OD280nm比值應(yīng)在1.6～2.0之間，OD260nm/OD230nm比值需≥2.0，濃度需≥1.0 ng/μl。保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3耳聾基因芯片檢測設(shè)備為晶芯LuxS-canTM10K-A微陣列芯片掃描儀及配套軟件，應(yīng)用遺傳性聾基因芯片檢測試劑盒(北京博奧生物有限公司)對GJB2基因的c.35delG、c.176del16、c.235delC、c.299delAT，GJB3基因的c.538C＞T，SLC26A4基因的c.2168A＞G、c.919-2A＞G，線粒體12SrRNA基因的m.1494C＞T、m.1555A＞G等4個耳聾基因共9個突變位點進行檢測。

1.4GJB2和SLC26A4基因Sanger測序分析對基因芯片檢測出GJB2純合突變、復(fù)合雜合突變和單雜合突變的患者進行GJB2全編碼序列分析驗證;對基因芯片未檢測到突變的病例進行GJB2基因全編碼序列分析。檢測出SLC26A4基因突變的病例進行第7+8、第19外顯子DNA測序以驗證基因芯片的準確性;對基因芯片未發(fā)現(xiàn)突變或發(fā)現(xiàn)為SLC26A4單雜合突變的患者進行SLC26A4編碼序列分析，先篩查第6、10、14、15、17外顯子，然后檢測剩余外顯子，直至發(fā)現(xiàn)另外一個致病突變或檢測完全部外顯子。GJB2、SLC26A4基因引物設(shè)計，PCR特異片段擴增體系、溫度、時間等條件的設(shè)置參照文獻［4，5］。PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，選取PCR擴增產(chǎn)物純化，送上海立菲生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.5序列比對分析DNA測序結(jié)果用DNAStar軟件包中的Seqman軟件與NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的GJB2標準序列(NC_ 000013.9)和SLC26A4標準序列(NC_000007.13)進行序列比對分析。

2　結(jié)果

2.1基因芯片檢測結(jié)果136例耳聾患者中共有20例檢測到GJB2、SLC26A4和線粒體12SrRNA基因突變，檢出率為14.71%(20/136)，野生型樣本合計為85.29%(116/136)，見表1。

13例檢測出GJB2基因突變，檢出率9.56% (13/136)。其中c.235delC突變11例，檢出率為8.09%(11/136)，包括c.235delC純合突變8例(其中1例伴SLC26A4基因c.919-2A＞G雜合突變)，c.235delC單雜合突變2例，復(fù)合雜合突變1例(基因型為c.235delC/c.299_300delAT)。c.299delAT突變2例，檢出率為1.47% (2/136 )，其中c.299delAT純合突變1例，c.299delAT單雜合突變1例。能明確基因突變?yōu)槎@病因的有10例(8例為c.235delC/c.235delC，1例為c.235delC/c.299_300delAT，1例為c.299 _300delAT/c.299 _ 300delAT)，占總體的7.35% (10/136)。未發(fā)現(xiàn)c.35delG和c.176del16突變位點。

6例檢測出SLC26A4基因突變，檢出率為4.41%(6/136)，其中，3例為單雜合突變(c.919-2A＞G/WT 2例，c.2168A＞G/WT 1例)，3例為c.919-2A＞G純合突變。能明確基因突變?yōu)槎@病因的有3例(均為c.919-2A＞G/c.919-2A＞G)，占總數(shù)的2.21%(3/136)。

1例女性患兒檢測出線粒體12SrRNA m.1555A ＞G均質(zhì)突變，檢出率為0.74%(1/136)。

本組對象中未檢測出GJB3突變。

表1　136例聾兒基因芯片檢測結(jié)果

2.2DNA測序結(jié)果分析對基因芯片發(fā)現(xiàn)的陽性病例進行Sanger測序驗證，符合率為100% (表2)。進行GJB2測序發(fā)現(xiàn)，2例c.235delC單雜合突變聾兒攜帶另外一個c.109A＞G雜合突變(基因型為c.109A＞G/c.235delC)，而1例c.299_300delAT單雜合突變聾兒未攜帶另外一個突變。2例c.919-2A＞G和1例c.2168A＞G單雜合突變病例經(jīng)SLC26A4基因序列分析后，其中1例c.919-2A＞G單雜合突變病例在第6號外顯子上發(fā)現(xiàn)另外一個突變(基因型為c.754T＞C/c.919-2A＞G)，另外1 例c.919-2A＞G和c.2168A＞G單雜合突變病例SLC26A4仍未發(fā)現(xiàn)其他突變。

116例基因芯片檢測結(jié)果顯示野生型的樣本中，檢測到4種已報道的GJB2基因多態(tài)性位點，其中c.109A＞G純合突變6例，c.109A＞G單雜合突變36例，c.79G＞A和c.341G＞A復(fù)合雜合突變18例，c.608T＞C單雜合突變8例。除了基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)的6例SLC26A4基因突變經(jīng)Sanger測序驗證完全相符外，還發(fā)現(xiàn)6種基因芯片未檢測出的SLC26A4基因突變(c.259G＞T、c.754C＞T、c.1229C＞T、c.1548_1549 insC、c.1705+5A＞G和c.2086C＞T)共計14例，其中1例c.259G＞T和c.1705+ 5A＞G復(fù)合雜合突變，c.754T＞C和c.1229C＞T單雜合突變各4例，c.1548_1549insC單雜合突變2例，c.2086C＞T單雜合突變2例，c.7547＞C和c.1229C＞T復(fù)合雜合突變1例，c.7547＞C和c.1548_1549 insC復(fù)合雜合突變1例。3例聾兒(基因型分別為c.259G＞T/c.1705+ 5A＞G、c.754T＞C/c.1229C＞T和c.754T＞C/c.1548_1549insC)，CT檢查結(jié)果均提示雙耳前庭水管擴大。

基因芯片聯(lián)合Sanger測序技術(shù)共檢測出34例患兒存在耳聾基因突變(GJB2基因多態(tài)性除外)，檢出率為25.00%(34/136)，其中GJB2和SLC26A4基因突變例數(shù)分別為13例(38.24%，13/34)和20例(58.82%，20/34) (表2)。

表2　Sanger測序技術(shù)進行耳聾基因分析結(jié)果

3　討論

GJB2和SLC26A4基因是非綜合征型聾中最常見的兩個致病基因，這兩種基因突變在耳聾病因中約占30%以上。中東人群GJB2熱點突變?yōu)閏.35delG［6］，而國人其熱點突變?yōu)閏.235delC［4］。文中結(jié)果顯示本組病例經(jīng)基因芯片技術(shù)檢出c.235delC和c.299delAT 2種GJB2基因突變類型，突變檢出率為9.56% (13/136)，其中以c.235delC突變?yōu)橹?，與國內(nèi)其他報道一致［4］。本組對象中發(fā)現(xiàn)1例GJB2基因c.235delC純合突變合并SLC26A4 c.919-2A＞G雜合突變患者，雖然基因芯片檢測結(jié)果已經(jīng)提示該患者是由于GJB2基因突變導(dǎo)致耳聾，但其攜帶的SLC26A4基因c.919-2A ＞G雜合突變?nèi)匀恢档藐P(guān)注，提示致病突變明確的耳聾患者還有可能攜帶其他耳聾致病基因突變，在人群篩查和遺傳咨詢的過程中應(yīng)注意這一現(xiàn)象。從文中結(jié)果看，116例基因芯片檢測結(jié)果顯示野生型的耳聾患者中，聯(lián)合Sanger測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)GJB2基因c.79G＞A、c.109A＞G、c.341G＞A和c.608T＞C等4種已知多態(tài)性位點，其在聾病人群和正常人群均有報道。c.109A＞G位點是一種比較特殊的基因變異，該基因變異的致病性曾存在一些爭議，近年來陸續(xù)有報道指出c.109A＞G與輕中度耳聾的發(fā)生有密切關(guān)系［7］，值得關(guān)注。

SLC26A4基因突變與散發(fā)性大前庭水管綜合征及Pendred綜合征關(guān)系密切，在歐洲患者中，c.1470A＞G和c.931T＞C是最常見的突變類型; 而c.919-2 A＞G和c.2168 A＞G是國人最常見的突變類型［5］。本組對象經(jīng)基因芯片檢測出2種SLC26A4基因突變類型，檢出率為4.41% (6/136) ; 而Sanger測序技術(shù)又發(fā)現(xiàn)6種突變類型，兩種技術(shù)聯(lián)合共發(fā)現(xiàn)8種突變類型20例基因突變患者，檢出率為14.70% (20/136)，占突變總?cè)藬?shù)的58.82% (20/34)，突變類型以c.754C＞T、c.919-2 A＞G 和c.1229C＞T突變?yōu)橹鳎琧.919-2A＞G基因突變檢出率略低于國內(nèi)其他地區(qū)［5］。聯(lián)合Sanger測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，c.259G＞T(p.Asn87Tyr)、c.754T＞C(p.Ser252Pro)、c.1229C＞T(p.The410Met)、c.1548_ 1549insC、c.1705+ 5A＞G和c.2086C＞T (p.Gln696Stop)等六種已知突變類型在耳聾突變數(shù)據(jù)庫(http://deafnessvariationdatabase.org/letter/s)和SLC26A4基因突變數(shù)據(jù)庫(http://www.healthcare.uiowa.edu/labs/pendredandbor/slcMutations.htm)有記錄，均為致病突變。本組病例檢出3例聾兒(基因型分別為c.259G＞T/c.1705+5A＞G、c.754T＞C/c.1229C＞T和c.754T＞C/c.1548_1549insC)，CT檢查結(jié)果均提示雙側(cè)前庭水管擴大。值得注意的是c.754T＞C和c.1229C＞T突變位點，在本組患者中有較高的突變頻率，與東亞地區(qū)其他人群基本一致，可望將這些位點應(yīng)用于基因芯片檢測中。雖然基因芯片具有快速、準確和低成本的優(yōu)勢，但無法發(fā)現(xiàn)新的和罕見的突變位點，結(jié)合Sanger測序法可以提高大前庭水管綜合征致病基因突變的檢出率［8］，但仍有無法確定病因的大前庭水管綜合征患者需進行進一步的耳聾基因篩查。

線粒體12SrRNA基因突變?yōu)榘被擒疹愔滤幬镄悦@的易感基因，以m.1555A＞G和m.1494C＞T最常見;其機制主要是由于氨基糖苷類抗生素在內(nèi)耳的外淋巴和內(nèi)淋巴聚積，使得m.1555A＞G或m.1494C＞T基因突變攜帶者的耳蝸細胞中的線粒體更容易受攻擊，從而對這些細胞形成組織特異性的損傷，最終導(dǎo)致攜帶該基因的個體發(fā)生聽力損傷［9］。G?pel等［10］報道德國新生兒的m.1555A＞G突變頻率僅為0.2%;而國人的該基因突變頻率為3.96%［11］。本組對象中檢出mtDNA基因12SrRNA m.1555A＞G均質(zhì)突變1例，該患兒氨基糖苷類抗生素應(yīng)用史不詳，家族中無其他耳聾患者，本研究結(jié)果對該患兒及其家系成員的藥物使用具有指導(dǎo)意義。

中國克隆的第一個耳聾基因GJB3中的c.538 C＞T和c.547 G＞A突變位點被認為與高頻聽力下降有關(guān)［12］。本組對象均未檢出GJB3基因突變。

由于遺傳性聾具有很高的遺傳異質(zhì)性，其基因診斷涉及到多個基因，故給基因診斷的臨床應(yīng)用帶來極大困難?；蛐酒夹g(shù)是隨著基因組計劃發(fā)展起來的生物技術(shù)，其出現(xiàn)和快速發(fā)展為高通量基因突變檢測帶來了新的曙光。中國人民解放軍總醫(yī)院與北京博奧生物技術(shù)有限公司共同開發(fā)了一款可同時檢測4個常見耳聾相關(guān)基因中的9個國人熱點突變的遺傳性聾基因診斷芯片，該技術(shù)將等位基因特異性引物延伸PCR與通用芯片相結(jié)合，具有簡便易行、成本較低、通量高等優(yōu)點?；蛐酒梢栽?小時內(nèi)完成PCR反應(yīng)到掃描全過程，完成9個位點的檢測，每張芯片可同時檢測4個個體，每次可同時檢測多張芯片，本組136例聾兒樣本在幾天內(nèi)即完成檢測;但其僅能夠檢測國人9個基因突變熱點，無法檢測少見或未知的突變類型。傳統(tǒng)的Sanger測序技術(shù)準確性高，可提供檢測基因全面的序列信息，但無法同時檢測多個基因多突變位點，存在高成本、耗時長等問題，如SLC26A4基因有21個外顯子，需要多個PCR反應(yīng)和測序反應(yīng)才能完成檢測。本研究采用上述兩種技術(shù)結(jié)合，通過基因芯片在20例聾兒中檢測出GJB2、SLC26A4和線粒體12SrRNA基因突變，總檢出率為14.71% (20/136)，檢測出10種基因型;而通過Sanger測序技術(shù)在34例聾兒中檢出GJB2、SLC26A4和12SrRNA基因突變，總檢出率為25%(34/136)，還發(fā)現(xiàn)了6種基因芯片未能檢測出的SLC26A4突變位點(c.259G＞T、c.754C＞T、c.1229C＞T、c.1548_1549insC、c.1705+ 5A＞G和c.2086C＞T)，共發(fā)現(xiàn)17種基因型。因此，進行大規(guī)模聾兒基因突變篩查時，可通過基因芯片進行初篩，對單雜合突變或檢測結(jié)果陰性的患兒再通過Sanger測序技術(shù)來尋找病因，這樣可提高耳聾基因突變的檢出率。

本研究結(jié)果表明，GJB2基因和SLC26A4基因是廣西狀族自治區(qū)聾兒康復(fù)中心耳聾患者最主要的致病基因，其中c.235delC、c.919-2A＞G和c.754T＞C最常見。在臨床應(yīng)用中，因遺傳性聾基因芯片檢測位點有限，部分患兒僅僅檢出單基因的雜合突變，可聯(lián)合Sanger測序技術(shù)進一步分析。隨著測序技術(shù)的普及和檢測成本的下降，多技術(shù)聯(lián)合使用將是耳聾基因診斷的必然趨勢。

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(2015-02-05收稿)

(本文編輯周濤)

·臨床研究·

Application of DNA Microarray and Sanger Sequencing to the Genetic Diagnosis of Nonsyndromic Hearing Loss

Wu Lidong*，Tang Ning，Yan Tizhen，Li Zhetao，Li Jianhong，Li Wugao，Pang Hong，Luo Shiqiang，Qiu Qi
(*Hearing Speech Rehabilitation Center of Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning，530001，China)

【Abstract】ObjectiveTo study genotypes in nonsyndromic hearing loss (NSHL) patients from Guangxi Zhuang Autonomous Region hearing speech rehabilitation center using DNA microarray in combination with Sanger sequencing.Methods Deaf patients received routine physical and otorhinolaryngoloical examinations as well as pure tone autiometry.Brainstem auditory evoked potential test was performed in uncooperative children.Blood samples were obtained from a total of 136 patients，male 81，female 55，age from one year five month to seventeen，having nonsyndromic hearing loss.Genomic DNA was extracted and then 9 hot mutation spots in 4 susceptibility genes were detected by DNA microarray.GJB2 and SLC26A was further detected by Sanger sequencing in the patients with negative results and heterozygotes.Results Among the 136 patients with nonsyndromic hearing loss，20 casesbook=570,ebook=7were positive for GJB2 gene，SLC26A4 gene or mitochondrial 12SrRNA gene mutations.There were 14.71%(20/136) patients were positive for hot mutation spots in the deafness related genes，25%(34/136) patients carried mutations of deafness related genes using DNA microarray in combination with Sanger sequencing.Six SLC26A4 rare mutations (c.259G＞T，c.754C＞T，c.1229C＞T，c.1548_1549insC，c.1705+5A＞G and c.2086C＞T) were detected by Sanger sequencing.c.235delC was the most common mutation in GJB2 gene.c.919-2A＞G，c.754C＞T and c.1229C＞T were the common mutations in SLC26A4 gene.The mutation rate of GJB2 and SLC26A4 was 38.24%.and 58.82%，respectively.ConclusionPrevalent deafness-associated gene mutations in the nine loci studied were less frequently detected in nonsyndromic hearing loss patients from Guangxi Zhuang Autonomous Region hearing speech rehabilitation center.It can improve the detection rate of deafness gene mutations by using gene microarray in combination with Sanger sequencing.GJB2 and SLC26A4 are the common causative genes.

【Key words】Nonsyndromic hearing loss; Susceptibility gene; DNA microarray; Sanger sequencing

通訊作者:嚴提珍(Email: 439078813@ qq.com)

作者簡介:伍麗東，女，廣西人，本科，主治醫(yī)師，研究方向為康復(fù)聽力學。

【中圖分類號】R764.43

【文獻標識碼】A

【文章編號】1006-7299(2015) 06-0569-06

DOI:10.3969/j.issn.1006-7299.2015.06.001

網(wǎng)絡(luò)出版時間:2015-9-10 16: 45

網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20150910.1645.004.html