快速定性檢測人呼吸道樣本中冠狀病毒基因芯片的制備方法及其效果評價

［摘要］目的探討冠狀病毒基因芯片的研制方法，建立一種快速定性檢測人咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等呼吸道感染樣本中的7種冠狀病毒和2種流感病毒核酸的方法。方法根據(jù)互聯(lián)網公布的10種呼吸道感染病毒的基因序列，設計了相應的引物和探針序列，經瓊脂糖凝膠電泳篩選驗證后，將探針點樣于醛基修飾基片，完成了檢測芯片制作。結果將聚合酶鏈式反應擴增產物用10倍梯度稀釋法稀釋后進行基因芯片檢測，結果表明可形成雜交斑點的最低檢測濃度為103copies/mL。結論研制的冠狀病毒基因芯片具有良好的特異度和靈敏度，可同時對SARS-CoV-2及其他呼吸道病毒同時進行高通量快速檢測。

［關鍵詞］冠狀病毒；流感病毒；基因芯片

doi：10.3969/j.issn.1674-7593.2024.02.002

Preparation Method of Gene Chip for Rapid Qualitative Detection of Coronavirus inHuman Respiratory Samples and Its Effect Evaluation

Zheng Haoyu1，Zheng Wenxue1，Gu Yinuo1，An Yiming1，Zhang Jiaqi1，Zhang Yuhan1，Zhang Shanshan1，Meng Xiaoting2**，Wang Fang1**

1Department of Pathogen Biology，School of Basic Medical Sciences，Jilin University，Changchun130021；2Department of Histology amp;Embryology，School of Basic Medical Sciences，Jilin University，Changchun130021

**Corresponding author：Meng Xiaoting，email：mengxt@jlu.edu.cn；Wang fang，email：wf@jlu.edu.cn

［Abstract］ObjectiveTo explore the development method of coronavirus gene chip，and to establish a method for rapid qualitative detection of nucleic acids of 7 coronaviruses and 2 influenza viruses in respiratory infection samples such as human throat swabs，sputum，and alveolar lavage fluid.MethodsAccording to the gene sequences of 10 kinds of respiratory infection viruses published on the Internet，the corresponding primers and probe sequences were designed.After screening and verification by agarose gel electrophoresis，the probes were spotted on the aldehyde base modified substrate，completed the detection chip fabrication.ResultsThe PCR amplification product was diluted by 10-fold serial dilution method and then detected by gene chip.The results showed that the lowest detection concentration that could form hybridization spots was 103copies/mL.ConclusionThe developed coronavirus gene chip has good specificity and sensitivity， and can be used for simultaneous high-throughput and rapid detection of SARS-CoV-2 and other respiratory viruses.

［Key words］Coronavirus；Influenza virus；Gene chip

人冠狀病毒（Human corona viruses，HCoVs）感染是引起人類呼吸道疾病的重要病原之一，在常見呼吸道病原體中冠狀病毒檢出率約為3％～10％，是引發(fā)咳嗽、發(fā)熱、喉炎、支氣管炎以及肺炎等臨床癥狀的重要病原［1-2］。目前冠狀病毒感染檢測主要通過熒光PCR技術，基因芯片技術一次性可檢測多種病毒，尤其當需要對臨床癥狀相近病原體進行鑒別或對同種屬病原體分型時，基因芯片技術方法可迅速確定病原體，從而避免檢測過程中耗時較長、檢測效率較低、檢測成本較高、檢測時效性不強、靈敏度低，特異度差等缺陷，能真正達到臨床需要，提高臨床療效［3］。節(jié)省了分析數(shù)據(jù)的時間，在更短的時間內得到多種病毒核酸檢測的數(shù)據(jù)信息。在冠狀病毒的鑒別診斷和監(jiān)控方面，尤其是針對新冠疫情病原體快速排查，該技術將發(fā)揮巨大優(yōu)勢［4］。目前基因芯片技術在冠狀病毒檢測方面的應用甚少，本研究擬通過探討冠狀病毒基因芯片的設計、研制及初步臨床試驗為新的冠狀病毒檢測方法奠定基礎。

1材料與方法

1.1冠狀病毒基因位點的確定

根據(jù)互聯(lián)網公布的10種呼吸道感染病毒的基

因序列，本研究確定了7種冠狀病毒：2019-nCov，SARS，MERS，HCoV-229E，HCoV-NL63，HCoV-OC43，HCoV-HKU1；3種常見的流感病毒：IFVA-H1N1，IFVA-H3N2和IFVB的特異性基因位點。

1.2試劑和儀器

生產本試劑盒所需的主要原材料分別為：酶、脫氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（Takara公司）、引物（生工生物工程上海股份有限公司）、探針（生工生物工程上海股份有限公司）、芯片（醛基修飾基片）（昆明寰基生物芯片產業(yè)有限公司）。

1.3芯片探針和引物的合成

針對每種病毒的候選保守基因設計了相應的檢測探針和檢測引物，合成了DNA探針和引物。并根據(jù)探針、引物組合進行了優(yōu)化，確定了引物序列。引物和探針序列見表1、表2。引物和探針的篩選見圖1。

1.4冠狀病毒芯片的制備

1.4.1探針緩沖液用點樣緩沖液將質檢合格后的探針稀釋為100 ng/μL的點樣工作液。

1.4.2芯片點樣將點樣工作液按芯片上樣圖加入384孔樣品板中，將醛基修飾基片裝載于點樣tray上，運行Arrayjet Marathon點樣儀的點樣程序進行芯片點樣，芯片探針布局見圖2。

1.4.3點樣后處理芯片點樣后經探針固定、封閉、洗脫、干燥后密封真空包裝。

1.4.4試劑配制（100 000級潔凈生產區(qū)）逆轉錄-聚合酶鏈式反應（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）擴增引物混合物的配制分裝：將引物凍干粉按裝量要求稀釋并混合為工作液濃度進行分裝。RT-PCR擴增試劑混合物的分裝：按照裝量要求，在低溫條件下對PCR擴增試劑混合物進行分裝。雜交緩沖液的配制分裝：按照雜交液組分進行緩沖液配制及分裝。芯片洗脫液的配制和分裝：按照芯片洗脫液配方配制20×SSC和10%SDS并進行分裝。

1.4.5陰性質控配制及分裝（10 000級潔凈生產區(qū)）將陰性質控克隆質粒模板稀釋至工作液濃度并進行分裝。

1.4.6試劑盒組裝將PCR擴增試劑混合物、PCR擴增引物混合物、雜交緩沖液、陰性質控放入試劑盒Ⅰ，將芯片、檸檬酸鈉緩沖液（20×SSC）、十二烷基硫酸鈉溶液（10%SDS）放入試劑盒Ⅱ，完成試劑盒組裝，按照規(guī)定的儲存條件入庫。

2結果

2.1基因芯片的靈敏度

將PCR擴增產物用10倍梯度稀釋法稀釋后進行基因芯片檢測，結果表明可形成雜交斑點的最低檢測濃度為103copies/mL。

2.2基因芯片的重復性

不同批次3個芯片和同批次10個芯片的基因位置、雜交質控和有效性控制清晰可見，陰性質控無信號，芯片背景值低，符合率100%。以上結果均表明該芯片具有良好的重復性。

2.3基因芯片的穩(wěn)定性

室溫避光保存6個月，芯片穩(wěn)定，基因芯片的檢測仍可正常進行。

2.4基因芯片雜交結果

芯片探針布局中：NC為陰性質控探針；IC為提取對照兼內對照探針；HC為雜交陽性對照探針；BC為空白點；（2019-nCoV） ORF1ab和E和N靶基因為新型冠狀病毒檢測探針；SARS、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1為冠狀病毒檢測探針；H1N1為甲型流感病毒的檢測探針；H3N2為甲型流感病毒H3N2的檢測探針；IFV-B為乙型流感病毒的檢測探針。對于任意探針位點，其熒光值中值≥1.5倍熒光背景值，判斷該位點為“陽性”，否則該位點判斷為“陰性”。判斷NC：若其2個重復位點中，滿足“陰性”的位點數(shù)等于2，則繼續(xù)進行基因芯片重復性判讀，否則判讀結果為“失敗”。判斷IC：若其2個重復位點中，滿足“陽性”的位點數(shù)等于2，則繼續(xù)進行基因芯片穩(wěn)定性判讀，否則判讀結果為“失敗”。判斷HC：若其2個重復位點中，滿足“陽性”的位點數(shù)等于2，則繼續(xù)進行基因芯片雜交結果判讀，否則判斷結果為“失敗”。判斷病原體檢測探針：例如US-2019-nCov-N探針，若其2個重復位點滿足“陽性”的位點數(shù)等于2，則判為新型冠狀病毒（2019-nCoV）檢測結果為“陽性”；否則判斷結果為“陰性”。陰性標準品和正常人標本基因芯片檢測結果見圖3，呼吸道感染病毒陽性標準品的基因芯片檢測結果見圖4。

3討論

流行病學研究表明，HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKUI這4種HCoVs在世界各地均有流行，呈全球性分布，臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、鼻炎、喉炎以及支氣管炎、肺炎等，給人類生命健康造成一定的威脅［5］。SARS-CoV和MERS-CoV這2種冠狀病毒感染人后卻能造成急性呼吸道癥狀，嚴重者引發(fā)呼吸系統(tǒng)和腎功能系統(tǒng)衰竭并造成死亡。

MERS-CoV作為近期出現(xiàn)的HCoVs，目前全球已有26個國家及地區(qū)報道了確診病例2 428例，死亡839例，死亡率高達34.6％［6］。2019新型冠狀病毒（2019-nCoV）的傳播速度快，傳播速度廣，嚴重危害人類健康，威脅人類生存環(huán)境［7］。

流行性感冒病毒，簡稱流感病毒，是一種造成人類及動物患流行性感冒的RNA病毒，屬于正黏液病毒科［8］。流感病毒侵襲的目標是呼吸道黏膜上皮細胞，感染后會造成急性上呼吸道感染。由于流感病毒可經空氣傳播，且會引起大范圍的流行，尤其是在免疫力低下的人群中會引起嚴重癥狀，如肺炎，心力衰竭等。臨床以突發(fā)、高熱、咳嗽、呼吸困難、衰竭、高發(fā)病率、低死亡率為主要特征［9］。輕癥流感的癥狀局限于上呼吸道，表現(xiàn)為發(fā)燒、喉痛、流涕、咳嗽、頭痛、肌肉疼痛以及疲勞；重癥流感或下呼吸道繼發(fā)性細菌感染會導致嚴重肺炎，甚至危及生命［10］。新病毒株在抗原性上與以往流行株非常不同，人類面對新病毒株缺乏免疫力往往導致嚴重感染以及死亡率激增。流感的暴發(fā)已有百年的歷史，每次流感疫情均給經濟發(fā)展和公共衛(wèi)生帶來巨大的損失，因此建立快速檢測流感病毒的診斷技術是預防和控制該疾病流行的一個重要保障。

基因芯片具有以下特點：①靈敏度和高特異度?，F(xiàn)代醫(yī)學檢測手段主要有兩類，一類是蛋白質，一類是核酸。其中核酸檢測是未來發(fā)展的方向。由于核酸可以用PCR方法擴增，只要檢測反應管中有1個分子存在，就可以被檢測到，PCR檢測技術的檢測靈敏度到達了當前檢測技術所能達到的極限，但該技術的缺陷是不能準確判斷擴增產物的特異度。基因芯片技術是將PCR技術和分子雜交技術相結合，由于分子雜交是可以準確判斷其雜交特異度的。因此，基因芯片技術是將目前靈敏度最高的技術與特異度最好的技術相結合，特異度和靈敏度都達到了空前的水平，這是其他任何技術都不能比擬的［11-13］。②高通量檢測。傳統(tǒng)檢測手段一次取樣，僅能對一個或者少數(shù)幾個指標進行檢測，無法實現(xiàn)全系統(tǒng)和全景式的檢驗?；蛐酒捎趯⒋罅可锾结樃鶕?jù)系統(tǒng)化高通量檢測的需求有機組合，實現(xiàn)了一次對一個系統(tǒng)（如泌尿生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等）的全景檢測，有利于對癥狀相似的疾病或復雜疾病進行準確快速判斷［14-17］。③避免了假陰性。由于病原體的變異較快，因此一旦檢測位點發(fā)生變異，檢測就無法進行，在基因芯片設計上可以針對每個待測項目設計多個檢測探針，實現(xiàn)了類似于“多次重復檢測取平均”的檢測過程，多位點的檢測使漏檢的概率大大降低［18-20］。④平行對照。傳統(tǒng)檢測手段由于檢測通量較低，只能將對照體系設計在檢測體系之外，與檢測流程同時進行?；蛐酒邆涞母咄刻匦?，在芯片設計時能夠在點陣中引入多種質控對照點，在檢測過程內部對標本采集，PCR擴增、雜交操作等環(huán)節(jié)進行質控，極大地提高了檢測的可靠性［21-25］。⑤成本大幅度降低。由于同時進行多項目檢測，平均到每個項目的檢測費用就相應降低。⑥快速方便，基因芯片一般是一個工作日可以出結果。而現(xiàn)有的其他技術都是逐項的檢測，多個項目進行下來，就需要幾天時間，這同時又可能因樣本保存時間過長導致檢測結果的錯誤。

本試劑盒具有快速、準確、客觀、定性檢測的優(yōu)點，能同時檢測臨床標本中的9種呼吸道感染病毒。包括7種冠狀病毒［2019-nCoV ORF1ab和N基因、E基因，SARS核酸，中東呼吸綜合征冠狀病毒（ORF1a基因）核酸，HCoV-229E核酸，HCoV-NL63核酸，HCoV-OC43核酸，HCoV-HKU1核酸］和2種流感病毒［甲型流感病毒IFV-A（H1N1、H3N2），乙型流感病毒IFV-B］的核酸，綜合檢測靈敏度達到5×103copies/mL，尤其適用于大樣本量的篩查，是一種非常有發(fā)展前景的檢測方法。

在國內，目前沒有類似基因芯片法的檢測產品。根據(jù)實用的重要性及檢測費用的經濟性，本產品選擇了9種呼吸道感染病毒進行檢測。利用基因芯片技術，能夠一次性、快速、準確地檢測病毒。從而真正達到臨床需要，提高臨床療效。

參考文獻

［1］Wu A，Peng Y，Huang B，et al.Genome composition and divergence of the novel coronavirus（2019-nCoV） originating in China［J］.Cell Host Microbe，2020，27（3）：325-328.

［2］Wilson AD，F(xiàn)orse LB.Potential for early noninvasive COVID-19 detection using electronic-nose technologies and disease-specific VOC metabolic biomarkers［J］.Sensors（Basel），2023，23（6）：2887.

［3］李達明，呂星，蔣傳好，等.基因芯片技術在腎移植術后患者肺部感染病原菌快速檢測中的臨床價值［J］.檢驗醫(yī)學，2022，37（9）：864-867.

Li DM，Lv X，Jiang CH，et al.Clinical application of gene chip technology for determining respiratory pathogens rapialy in pulmonary infection patients after renal transplantation［J］.Lab Med，2022，37（9）：864-867.

［4］張燦輝，劉志新，吳建輝，等.病原學基因芯片對重癥肺炎應用價值探討［J］.社區(qū)醫(yī)學雜志，2022，20（6）：338-342.

Zhang CH，Liu ZX，Wu JH，et al.Explore the application value of pathogenic gene chip microarray in patients with severe pneumonia［J］.J Community Med，2022，20（6）：338-342.

［5］Meral Y，Elif F，Gasia K.COVID-19 diagnosis-a review of current methods［J］.Biosens Bioelectron，2021，172：112752.

［6］Gao ZR，Xu YH，Sun C，et al.A systematic review of asymptomatic infections with COVID-19［J］.J Microbiol Immunol Infect，2021，54（1）：12-16.

［7］Walter LA，McGregor AJ.Sex-and gender-specific observations and implications for COVID-19［J］.Western J Emerg Med，2020，21（3）：507-509.

［8］Te Velthuis AJ，F(xiàn)odor E.Influenza virus RNA polymerase：insights into the mechanisms of viral RNA synthesis［J］.Nat Rev Microbiol，2016，14（8）：479-493.

［9］Vanderlinden E，Naesens L.Emerging antiviral strategies to interfere with influenza virus entry［J］.Med Res Rev，2014，34（2）：301-339.

［10］Watanabe T，Watanabe S，Kawaoka Y.Cellular networks involved in the influenza virus life cycle［J］.Cell Host Microbe，2010，7（6）：427-439.

［11］葉書緣，孫春麗，高國生，等.基因芯片法檢測寧波地區(qū)結核分枝桿菌耐藥性的研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2022，32（1）：51-55.

Ye SY，Sun CL，Gao GS，et al.Study of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis by gene chip in Ningbo area［J］.Chin J Health Lab Technol，2022，32（1）：51-55.

［12］麥艷媚.實時熒光PCR與基因芯片法檢測人乳頭瘤病毒的方法學比較［J］.吉林醫(yī)學，2021，42（12）：2882-2884.

Mai YM.Methodological comparison of real-time fluorescent PCR and gene chip method for HPV detection［J］.Jilin Med J，2021，42（12）：2882-2884.

［13］孫青，宋華峰，黃帆.基于基因芯片技術對耐利福平或異煙肼結核分枝桿菌基因突變位點的檢測分析［J］.抗感染藥學，2023，20（10）：1108-1112.

Sun Q，Song HF，Huang F.Detection and analysis of rifampicin-resistant or isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis gene mutation sites based on gene chip technology［J］.Anti Infect Pharm，2023，20（10）：1108-1112.

［14］Wang XW，Gao HJ，F(xiàn)ang DC.Advances in gene chip technique in Barrett's metaplasia and adenocarcinoma［J］.J Dig Dis，2008，9（2）：68-71.

［15］Yin G，Bie S，Gu H，et al.Application of gene chip technology in the diagnostic and drug resistance detection of Helicobacter pylori in children［J］.J Gastroenterol Hepatol，2020，35（8）：1331-1339.

［16］劉耐，邢寶春，冷霞，等.基因芯片技術對非結核分枝桿菌肺病的診斷價值［J］.實用醫(yī)技雜志，2022，29（11）：1147-1150.

Liu N，Xing BC，Leng X，et al.Diagnostic value of gene chip technology in nontuberculous mycobacterium pulmonary disease［J］.J Pract Med Tech，2022，29（11）：1147-1150.

［17］Luo Y，Du J，Zhan Z，et al.A diagnostic gene chip for hereditary spastic paraplegias［J］.Brain Res Bull，2013，97：112-118.

［18］楊映暉，伍定輝，蘇偉明，等.基因芯片法在結核分枝桿菌耐藥基因快速診斷中的應用價值［J］.中國防癆雜志，2020，42（11）：1191-1195.

Yang YH，Wu DH，Su WM，et al.Evaluation of gene chips for the rapid diagnosis of drug-resistance genes in Mycobacterium tuberculosis［J］.Chin J Antituberc，2020，42（11）：1191-1195.

［19］冉楠，馬明星，龐志強，等.血栓形成易感基因芯片的研制及效果評價［J］.吉林大學學報（醫(yī)學版），2020，46（1）：182-187.

Ran N，Ma MX，Pang ZQ，et al.Development and evaluation of thrombosis susceptibility gene chip［J］.J Jilin Univ（Medicine Edition），2020，46（1）：182-187.

［20］袁語澤，馬明星，王國強，等.血栓性疾病個體化用藥指導基因芯片試劑盒的制備和效果評價［J］.吉林大學學報（醫(yī)學版），2019，45（6）：1267-1274，1481-1482.

Yuan YZ，Ma MX，Wang GQ，et al.Preparation of gene chip detection kit for individualized treatment of thrombotic diseases and evaluation on its effectiveness［J］.J Jilin Univ（Medicine Edition），2019，45（6）：1267-1274，1481-1482.

［21］蘭金芝，劉揚，徐澍，等.HPV基因芯片檢測質控點設計和參數(shù)優(yōu)化研究［J］.貴州醫(yī)科大學學報，2018，43（10）：1221-1226.

Lan JZ，Liu Y，Xu S，et al.Design of quality control and parameter optimization for HPV gene chip detection［J］.J Guizhou Med Univ，2018，43（10）：1221-1226.

［22］戈海澤，梁慧敏，盧晉英，等.基因芯片技術在常見腸道致病菌感染檢測中的應用［J］.山東醫(yī)藥，2013，53（4）：24-26，29，103.

Ge HZ，Liang HM，Lu JY，et al.Detection of common intestinal pathogens infection with gene chip technology［J］.Shandong Med J，2013，53（4）：24-26，29，103.

［23］李深偉，張子龍，李帥，等.高通量基因芯片技術在登革病毒檢測和分型中的應用［J］.中國國境衛(wèi)生檢疫雜志，2019，42（3）：163-165.

Li SW，Zhang ZL，Li S，et al.An integrated high-throughput lab-on-chip method for rapid identification and typing of dengue virus［J］.Chin J Front Health Quarant，2019，42（3）：163-165.

［24］趙嫻，王驥，周冬青.基因芯片技術在監(jiān)測乙型肝炎病毒耐藥突變中的應用及臨床意義［J］.世界最新醫(yī)學信息文摘，2018，18（84）：1-2.

Zhao X，Wang J，Zhou DQ.Application and clinical significance of gene chip technology in monitoring hepatitis B virus resistance mutation［J］.World Latest Med Inf，2018，（84）：1-2.

［25］楊艷兵，胡海英，吳茱萸，等.基因芯片技術在成人下呼吸道感染病原學檢測中的臨床應用及評價［J］.廣東醫(yī)學，2019，40（21）：3025-3029.

Yang YB，Hu HY，Wu ZY，et al.Clinical application and evaluation of gene chip technology in the pathogen detection of adult lower respiratory tract infection［J］.Guangdong Med J，2019，40（21）：3025-3029.

（2023-10-26收稿）