奶牛乳房炎診斷方法研究進(jìn)展

薛永康+王新莊+閆躍飛+楊文華+任小麗+閆磊

摘要：奶牛乳房炎是造成奶牛業(yè)損失最主要的原因。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，奶牛乳房炎的診斷方法也有了長足的發(fā)展。特別是現(xiàn)代生物技術(shù)在微生物檢測領(lǐng)域應(yīng)用之后，奶牛乳房炎的診斷周期大大縮短、操作簡單快捷、檢測成本降低、靈敏度提高。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）技術(shù)在奶牛乳房炎主要病原診斷中的應(yīng)用也極大地推動了奶牛乳房炎檢測技術(shù)的發(fā)展。

關(guān)鍵詞：奶牛；乳房炎；診斷方法；PCR；基因芯片；LAMP

中圖分類號：S858.23 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1007-273X（2016）08-0015-03

奶牛乳房炎（Bovine mastitis）是由病原微生物感染而引起的乳房組織及乳頭發(fā)炎的一種疾病，是造成奶牛業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最主要的原因[1]。在中國，奶牛乳房炎每年造成的經(jīng)濟(jì)損失無法估量。奶?；疾『?，不但造成產(chǎn)乳量和乳品質(zhì)的下降，而且，還可能造成奶牛產(chǎn)后發(fā)情期和妊娠期延長，甚至危及人類健康。

1 概述

奶牛乳房炎，又稱奶牛乳腺炎，是一種由病原微生物感染、機(jī)械性傷害、物理性損傷和化學(xué)物質(zhì)刺激所引起的較為復(fù)雜的奶牛乳腺綜合征疾病，也是奶牛發(fā)病率最高、造成損失最嚴(yán)重的疾病之一。長期以來，該病一直困擾著中國乃至世界乳業(yè)發(fā)展，它不僅引起奶產(chǎn)量下降，而且嚴(yán)重影響乳的品質(zhì)，甚至危害到人類的健康。美國乳房炎委員會（NMC）在1978年，根據(jù)乳汁和乳房的肉眼可見變化情況，將乳房炎分為隱性乳房炎和臨床型乳房炎兩種，其中隱性乳房炎占總發(fā)病的77%～79%，臨床型乳房炎占奶?？偘l(fā)病的21%～23%。

1.1 臨床型乳房炎

臨床型乳房炎癥狀明顯，輕者表現(xiàn)為乳房皮膚發(fā)紅、乳汁稀薄，有少量絮狀物，用手觸摸患牛乳房，患牛乳房疼痛不明顯。重者表現(xiàn)為精神萎靡，食欲減退，體溫升高，產(chǎn)奶量明顯下降，乳汁稀薄且乳汁內(nèi)混有大量絮狀物、凝乳塊或血液，乳區(qū)質(zhì)地硬、腫脹，手觸患牛疼痛明顯。因此，臨床型乳房炎根據(jù)臨床表現(xiàn)的癥狀，極易做出判斷。

1.2 隱性乳房炎

隱性乳房炎不表現(xiàn)臨床癥狀，乳汁也無肉眼可見的變化，只是產(chǎn)奶量下降，實驗室檢測乳汁略偏堿性，體細(xì)胞數(shù)多達(dá)5×105 個/mL以上。

2 診斷

奶牛乳房炎要早診斷、早治療，以降低養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)損失。

2.1 病原微生物檢查

乳房炎主要由多種非特定的病原微生物引起，如細(xì)菌、真菌、病毒等。較常見的有27種，其中細(xì)菌12種，霉形體2種，真菌和病毒7種。病原微生物的分離培養(yǎng)和鑒定是實驗室診斷奶牛乳房炎病原的一種重要方法，它不僅可以鑒別病原種類也能確定細(xì)菌的數(shù)量。首先將無菌采集的新鮮奶樣接種于培養(yǎng)基，經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)、乳汁涂片、革蘭氏染色、鏡檢等反復(fù)純化病原菌。然后，對已經(jīng)純化的細(xì)菌用全自動細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行鑒定。選擇性培養(yǎng)基的應(yīng)用，也提高了病原分離鑒定的效率。如改良愛德華培養(yǎng)基（Modified Edwards Medium Base，MEM）用于選擇性分離鏈球菌、卻普曼瓊脂（Chapman Agar，CA）用于選擇性分離金黃色葡萄球菌、麥康凱培養(yǎng)基（Mac Conkey Agar，MCA）用于選擇性分離腸桿菌、PPLO培養(yǎng)基（Pleuropneumonia-Like Organisms，PPLO）用于選擇性分離支原體、腦心浸液培養(yǎng)基（Brian Heart Infusion，BHI）和血平板培養(yǎng)基（Blood Agar，BA）用于病原菌盲篩。

病原微生物分離鑒定法只能根據(jù)檢測出病原菌的種類、數(shù)量對乳房炎發(fā)病情況進(jìn)行大致判斷。從分離培養(yǎng)到利用全自動細(xì)菌鑒定儀鑒定需24 h才能確診，該方法對實驗操作人員要求較高且檢測速度較慢。

2.2 乳汁體細(xì)胞檢測

奶牛發(fā)生乳房炎后，白細(xì)胞數(shù)顯著增加，這是因為在乳腺受到細(xì)菌感染后，細(xì)菌的代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)大量的多形核白細(xì)胞（PMN）進(jìn)入乳腺細(xì)胞，隨后損傷脫落的上皮細(xì)胞也進(jìn)入乳中，致使乳汁中的體細(xì)胞增加。所以，奶牛是否患有隱性乳房炎可以通過檢測乳汁中體細(xì)胞數(shù)目來判斷。

國外專家發(fā)明了直接顯微鏡計數(shù)法來推斷體細(xì)胞數(shù)目，明確規(guī)定乳汁中體細(xì)胞數(shù)超過5×105個/mL可診斷為乳房炎。但是，中國農(nóng)科院中獸醫(yī)研究所根據(jù)試驗，提出治療乳房炎判定療效標(biāo)準(zhǔn)，每毫升乳汁中細(xì)胞數(shù)降至1×106個/mL以下就可定為正常。

CMT（加州乳房炎測試法），在CMT試液的作用下，乳汁細(xì)胞中的脂類物質(zhì)發(fā)生乳化，乳汁細(xì)胞被破壞，釋放出的DNA發(fā)生沉淀或凝塊，根據(jù)其量的多少來間接判定乳中細(xì)胞數(shù)的多少而達(dá)到診斷的目的方法[2]。有學(xué)者在現(xiàn)有各種診斷方法的比較試驗的基礎(chǔ)上，采取各種不同新合成的國產(chǎn)表面活性劑組成多種配方進(jìn)行篩選，選定了SMT-Ⅰ，SMT-Ⅱ，SMT-Ⅲ3種隱性乳房炎診斷液。試驗結(jié)果表明，SMT系列診斷液反應(yīng)敏感，尤其是SMT-Ⅰ試液，只需5s即可顯示結(jié)果。其他間接檢驗，有2%苛性鈉凝乳法和過氧化氫酶法。過氧化氫酶法是通過檢測白細(xì)胞中的過氧化氫酶來推斷乳中白細(xì)胞含量的。

2.3 乳汁pH檢查

泌乳奶牛乳汁的正常pH在6.2～6.6之間，且堿性會隨著乳房炎癥狀的加劇而升高。原因在于牛奶pH值的變化與體細(xì)胞和炎性細(xì)胞的含量呈正相關(guān)，隨著炎癥反應(yīng)的加重，血管滲透性增加，導(dǎo)致牛乳pH逐漸升高，因此可以通過檢測乳汁pH值的方法來檢測乳房炎[3，4]?，F(xiàn)在這種診斷方法已在美、法、德等國家多個牧場作為檢測和控制奶牛乳房炎的重要措施進(jìn)行推廣。在國內(nèi)，研究人員研制的奶牛乳房炎pH試紙已經(jīng)在牧場應(yīng)用和推廣。日本研制出以乳汁中分離出的乳清為檢測樣品的BPB濾紙片診斷乳房炎的方法。有關(guān)專家對BPB法進(jìn)行進(jìn)一步改進(jìn)，利用試驗證明，全乳BPB診斷法的準(zhǔn)確性可靠而且靈敏性較高。

2.4 乳汁導(dǎo)電性檢查

奶牛乳腺有炎癥后，乳腺上皮細(xì)胞造乳糖功能下降，血-乳屏障的滲透性改變，致使血液成分滲入乳汁的能力加強(qiáng)，乳汁中的Na+、Cl-、K+和Ca2+進(jìn)入乳汁，使乳汁電導(dǎo)率值升高[5]。乳汁電導(dǎo)率法是通過檢測乳汁的電導(dǎo)率的變化來監(jiān)測奶牛乳房炎的。研究表明，奶牛乳房炎乳汁的電導(dǎo)率均高于正常值，但在不同的個體及不同的飼養(yǎng)管理狀況下，乳汁的電導(dǎo)率變化較大，因此，判斷隱性乳房炎的關(guān)鍵是確定不同牛群正常乳汁電導(dǎo)率的閾值[6]。

1983年，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)郝慶銘教授研制出同類型奶牛乳房炎診斷儀，命名為SX-IE型。隨后，他又研制出具有國際領(lǐng)先水平的ZRD（以前稱CN）型乳牛乳腺炎電子檢測儀。ZRD型乳牛乳腺炎電子檢測儀重量輕，體積小，可在牛舍旁進(jìn)行測定。相信隨著科技的發(fā)展，畜牧科研人員一定能研究出診斷更為準(zhǔn)確，便于操作和掌握的新方法，為奶牛養(yǎng)殖戶做出貢獻(xiàn)。

2.5 酶檢驗法

酶檢測法是目前國內(nèi)外奶牛乳房炎診斷方法的研究熱點之一。乳房炎會導(dǎo)致乳汁中一些酶的生物活性升高，例如乳酸脫氫酶（LDH）、黃嘌呤氧化酶L8J、過氧化氫酶、N-乙?；?β-D-氨基葡萄糖苷酶、β葡糖苷酸和乳酸過氧化氫酶（LP）等，其活性與SCC的相關(guān)性很高[7]。其中一些酶（如過氧化氫酶、NAGnse和抗胰蛋白酶）的活性變化特點已用于診斷奶牛乳房炎及評價奶牛乳房炎的健康狀況[8]。

2.6 PCR檢測

PCR技術(shù)檢測法是一種在分子水平分離和檢測乳房炎主要病原的方法，基于細(xì)菌rRNA操縱元 16S rRNA和23S rRNA間隔區(qū)序列的PCR技術(shù)作為一種新的細(xì)菌分類和鑒定方法[9]得到了廣泛的應(yīng)用，并取得了較好的應(yīng)用效果。該方法優(yōu)點是對某些細(xì)菌不經(jīng)過培養(yǎng)過程，直接用奶樣就可以進(jìn)行細(xì)菌學(xué)鑒定，減少了病原菌間的所需的時間和費用，經(jīng)濟(jì)有效、快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)，具有重要的應(yīng)用價值[10，11]。張普瑞等[12]在對金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌3種主要的乳房炎致病菌建立多重PCR檢測時發(fā)現(xiàn)多重PCR方法的特異性為100%，最低檢測濃度為1.25×103 CFU/mL，充分證明了該方法具有快速、準(zhǔn)確和特異性的優(yōu)點。Riffon等[13]研制出用PCR方法檢測誘發(fā)乳房炎的6種病原菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和副乳房鏈球菌）的技術(shù)。

2.7 被毛微量元素檢測法

田鳳林等[14]在研究微量元素含量與乳房炎的相關(guān)性時發(fā)現(xiàn)患有乳房炎的奶牛乳汁中Cu、Fe、Co和Zn含量顯著低于正常乳汁（P<0.05或P<0.01），乳房炎與微量元素含量具有相關(guān)性。還有研究發(fā)現(xiàn)隱性乳房炎奶牛被毛中的Zn、Co、Mn的含量比正常牛只有一定相關(guān)性，隱性乳房炎病牛被毛中Zn、Ca顯著低于正常牛被毛中含量。但是，由于個體差異、營養(yǎng)、季節(jié)等影響，該診斷方法并不是非常準(zhǔn)確，還有待進(jìn)一步地研究。

2.8 蛋白質(zhì)組學(xué)檢測法

蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）是基因組學(xué)的重要組成部分，在功能基因組學(xué)研究中占據(jù)重要地位，近年來對白細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)、差異蛋白組學(xué)、病原微生物蛋白組學(xué)等的研究有了突破性的進(jìn)展，使得蛋白質(zhì)組學(xué)成為診斷乳房炎的一個新的研究熱點。

2.9 基因芯片檢測法

基因芯片技術(shù)可以實現(xiàn)多種病原微生物的同時檢測，大大縮短了奶牛乳房炎的診斷時間，使那些不能培養(yǎng)或很難培養(yǎng)的病原微生物也能被快速檢出[15]。邢會杰等[16]建立了一套基于16S rRNA的檢測奶牛乳房炎4種主要致病菌（無乳鏈球菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌）的基因芯片方法，通過對雜交條件進(jìn)行優(yōu)化，研制了與之相應(yīng)的價格低廉、易于推廣的小型操作平臺，其檢測靈敏度是PCR檢測的10倍。目前，國外已有商品化的奶牛乳房炎專用基因芯片，它可以同時檢出包含7種導(dǎo)致奶牛乳房炎的細(xì)菌，即金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、牛鏈球菌和牛支原體，在組裝的試劑盒中包括了能從DNA提取到的基因芯片的所有試劑，使檢測程序標(biāo)準(zhǔn)化，并且可以在6 h內(nèi)得到檢測結(jié)果[17]。2009年，李守軍等[18]以大腸桿菌16S rRNA保守區(qū)為基底序列，在6種奶牛乳房炎主要致病菌（無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯氏菌、變形桿菌和金黃色葡萄球菌）的可變區(qū)域內(nèi)設(shè)計了特異性寡核苷酸雜交探針，發(fā)明了奶牛乳房炎主要致病菌的檢測基因芯片，該技術(shù)操作步驟簡單，便于推廣使用。

2.10 LAMP快速分子診斷法

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）技術(shù)是在體外等溫條件下進(jìn)行的、一種新型的用于擴(kuò)增特異性核酸片段的方法，為2000年日本榮研株式會社學(xué)者Notomi等人所發(fā)明。該反應(yīng)只需耍將鏈置換型DNA合成酶、引物、基因模板、反應(yīng)液共同置于一定的溫度條件下（60～65 ℃），經(jīng)一個反應(yīng)步驟即可完成。該技術(shù)突破了傳統(tǒng)的PCR技術(shù)需耍多個循環(huán)變溫，即每個循環(huán)進(jìn)行熱變性以獲得單鏈DNA模板、反復(fù)升溫降溫實現(xiàn)退火、延伸的耗時過程，LAMP技術(shù)實現(xiàn)并完成了在恒溫條件下進(jìn)行核酸DNA的連續(xù)快速擴(kuò)增的目的，且具有相較于普通PCR更為高效的擴(kuò)增效率與靈敏度。

由于LAMP兩對引物在設(shè)計時針對于靶基因DNA鏈上的6個特異性的區(qū)域位點，因而極大提高了LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的特異性，且只需根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的有無、即可確認(rèn)靶基因序列是否存在。LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物可通過傳統(tǒng)常規(guī)的核酸電泳、焦磷酸鎂濁度檢測、簡易直視的熒光目測比色進(jìn)行結(jié)果判斷。LAMP技術(shù)簡單、快速、特異性強(qiáng)，作為嶄新的核酸擴(kuò)增方法，擺脫了昂貴復(fù)雜的儀器設(shè)備和反應(yīng)試劑的限制，反應(yīng)時間短，檢測結(jié)果判斷簡單，十分利于在基層機(jī)構(gòu)推廣與應(yīng)用。目前，以LAMP技術(shù)為代表的分子快速診斷技術(shù)已日漸成熟，并已經(jīng)在人類生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用，但在動物疫病診斷與防控中的應(yīng)用目前尚不多見，發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

目前，國內(nèi)已經(jīng)有了商品化的基于LAMP技術(shù)基因芯片，該芯片上有24個反應(yīng)室，其中包含16種引起奶牛乳房炎的主要病原菌、2種耐藥基因、陰陽性對照各1個以及4個空白室。該芯片采用人工提取核酸，機(jī)器校準(zhǔn)核酸濃度，實時濁度儀監(jiān)測反應(yīng)室濃度變化等方法來快速鑒別診斷病原菌，整個過程僅需4 h。

3 小結(jié)

奶牛乳房炎發(fā)病急，造成損失快，如何能夠快速準(zhǔn)確地診斷該病一直是奶牛業(yè)的首要難題?，F(xiàn)階段降低奶牛乳房炎的發(fā)生的主要措施有：抗病奶牛選育、提高飼養(yǎng)管理和及時地診斷治療。其中抗病奶牛選育是一個長期的過程，目前有不少學(xué)者在研究預(yù)防乳房炎的疫苗，雖然有一定效果，但并不理想[15]。因此，提高飼養(yǎng)管理和及時診斷治療成為目前控制乳房炎發(fā)病的關(guān)鍵。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，PCR、LAMP等分子診斷技術(shù)作為一種檢測方法在奶牛乳房炎、尤其是隱性乳房炎上表現(xiàn)出巨大的診斷潛力。應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行早期、快速、準(zhǔn)確地診斷將成為控制奶牛乳房炎的趨勢，這對于奶牛乳房炎的診療十分關(guān)鍵，應(yīng)用前景廣闊。

參考文獻(xiàn)：

[1] 馮萬宇，史同瑞，許臘梅.奶牛乳房炎的診斷與防制研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008（4）：79-80.

[2] 姜永剛，楊 昆.奶牛隱性乳房炎的診治方法[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2009（2）：46.

[3] 曲家華，周慶民.奶牛隱性乳房炎的幾種檢測方法[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問，2012（10）：155.

[4] 劉文進(jìn)，陳創(chuàng)夫，滕文軍，等.患隱性乳房炎奶牛乳汁pH變化與體細(xì)胞關(guān)系的研究[J].畜牧與獸醫(yī)，2005，37（3）：9-11.

[5] 楊柏齡.奶牛隱性乳房炎的檢測[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2013（2）：55.

[6] 劉建平，杜 江，劉 琴.奶牛乳房炎研究概況[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008（S1）：40-41.

[7] VIGUIER C，ARORA S，GILMARTIN N，et al.Mastitis detection：current trends and future perspectives[J].Trends in Biotechnolgy，2009，27（8）：486-493.

[8] 楊德英，曹隨忠，劉長松，等.奶牛隱性乳房炎診斷新指標(biāo)研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（9）：3665-3666.

[9] GILLESPIE B E，OLIVER S P.Simultaneous detection of mastitis pathogens，Staphylo-coccus aureus，Streptococcus uberis，and Streptococcus agalactiae by multiplex real-time polymerase chain reaction[J].J Dairy Sci，2005，88（10）：3510-3518.

[10] LEE S，QUESNELL M，F(xiàn)OX L K，et al.Characrerization of staphylococcal bovine mastitis isolates using the polymerase chain reaction[J].Food Prot，1998，61（10）：1384-1386.

[11] 肖 穎，谷維娜，錢明明，等.奶牛隱性乳房炎多重PCR檢測方法研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（17）：9029-9031，9112.

[12] 張善瑞，王長法，高運東，等.檢測奶牛乳房炎主要病原菌的多重PCR方法的建立與應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2008，28（5）：573-575.

[13] RIFFON R，SAYASITH K，KHALIL H，et al.Development of a rapid and sensitive test for identification of major pathogens in bovine mastitis by PCR[J]. J Clin Microbiol，2001，39（7）： 2584-2589.

[14] 田鳳林，董雪松，王銀平，等.乳房炎與正常乳中六種微量元素測定與分析[J].中國奶牛，2011（12）：41-44.

[15] 李忠浩，王 麗.奶牛乳房炎分子診斷技術(shù)的研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012（7）：31-32.

[16] 邢會杰，曹榮峰，師志海，等.奶牛乳房炎主要致病菌16S rDNA基因芯片檢測方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2008（12）：939-943.

[17] 張 莉.奶牛乳房炎分子診斷技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（7）：181-183.

[18] 李守軍，楊 林，邢會杰.奶牛乳房炎主要致病菌的檢測基因芯片及檢測方法[P].中國專利：CN101492739，2009-07-29.