藍(lán)翹解毒口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的改進(jìn)

鞏偉 李興東 孫旭 趙慶華 張欣欣 張琨 趙梅

[摘要] 目的 對藍(lán)翹解毒口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行改進(jìn)。 方法 采用薄層色譜法（TLC）鑒別制劑中的板藍(lán)根，氣相色譜法（GC）鑒別制劑中的廣藿香，高效液相色譜法（HPLC）測定制劑中連翹苷的含量。 結(jié)果 TLC法鑒別供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點；GC法檢測供試品色譜中呈現(xiàn)與對照品色譜峰保留時間相同的色譜峰；HPLC法含量測定中連翹苷在9.387～300.4 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9999，n=6），加樣回收率為99.62%，RSD為1.21%（n = 9）。 結(jié)論 本研究建立的方法結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定性好，專屬性強(qiáng)，改進(jìn)后的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可用于藍(lán)翹解毒口服液的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 藍(lán)翹解毒口服液；薄層色譜法；氣相色譜法；高效液相色譜法；板藍(lán)根；廣藿香；連翹苷

[中圖分類號] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）01（c）-0095-05

藍(lán)翹解毒口服液為《解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》2002年版收載品種[1]，臨床用于預(yù)防和治療病毒性感冒、病毒性腦炎等。該藥處方由板藍(lán)根、蘆根、山豆根、郁金、連翹、石膏、石菖蒲、廣藿香、荊芥、地黃、知母等11味中藥組成。該藥原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有針對山豆根和連翹的薄層色譜鑒別等檢驗項目，無含量測定。在軍隊醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高工作展開之際，為更有效地控制藍(lán)翹解毒口服液的質(zhì)量，本試驗對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提高，其中采用薄層色譜法（TLC）對板藍(lán)根進(jìn)行定性分析，氣相色譜法（GC）法對廣藿香進(jìn)行定性分析，高效液相色譜法（HPLC）對連翹進(jìn)行定量分析，現(xiàn)報道如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器

GC2010氣相色譜儀（日本島津公司）；LC-20AT液相色譜儀（日本島津公司）；AUW220D電子分析天平（日本島津公司）；Synergy-UV超純水器（法國Millipore公司）；TLA-1薄層觀察分析儀（湖南長沙克羅瑪科技有限公司）。

1.2 試藥

板藍(lán)根對照藥材（批號：121177-201105），亮氨酸對照品（批號：140687-200401），精氨酸對照品（批號：140685-201003），百秋李醇對照品（批號：110772-201105），連翹苷對照品（批號：110821-201112，含量測定以95.3%計算），以上標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購自中國藥品生物制品檢定研究院；乙腈、萘為色譜純（Honeywell），水為自制超純水，硅膠G薄層板購自煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所（批號：120924），其他試劑均為分析純。藍(lán)翹解毒口服液為濟(jì)南軍區(qū)聯(lián)勤部2014年度抽驗制劑品種（規(guī)格每支裝10 mL，批號：20140108、20140224、20140128、20130923，生產(chǎn)單位分別為解放軍第一五四醫(yī)院、第一五五醫(yī)院、第一五九醫(yī)院、第三七一醫(yī)院，陰性對照制劑委托解放軍第三七一醫(yī)院配制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC法行板藍(lán)根定性分析

取本品10 mL，蒸干，殘渣加稀乙醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取缺板藍(lán)根的陰性對照制劑10 mL，同法制成陰性對照溶液。另取板藍(lán)根對照藥材1.0 g，加稀乙醇20 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加稀乙醇2 mL使溶解，制成對照藥材溶液。再取亮氨酸對照品、精氨酸對照品適量，加稀乙醇制成每1毫升各含0.5 mg的混合溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法[2]附錄34-35試驗，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（19∶5∶5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上應(yīng)顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。薄層色譜圖見圖1。

2.2 GC法行廣藿香定性分析

取本品100 mL，置500 mL圓底燒瓶中，加水100 mL與玻璃珠數(shù)粒，連接揮發(fā)油測定器，自測定器上端加水使充滿刻度部分，并溢流入燒瓶為止，再加入環(huán)己烷2 mL，連接回流冷凝管，加熱回流2 h，冷卻，取環(huán)己烷液，加入適量無水硫酸鈉，振搖，取上清液作為供試品溶液。另取缺廣藿香的陰性對照制劑100 mL，同法制備陰性對照溶液。另取百秋李醇對照品適量，加環(huán)己烷制成每l毫升含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。照氣相色譜法[2]附錄38-39試驗，用以5%苯基甲基聚硅氧烷為固定相的毛細(xì)管柱（柱長為30 m，內(nèi)徑為0.32 mm，膜厚度為0.25 μm）；柱溫為程序升溫：初始溫度170℃，以每分鐘2℃的速率升溫至180℃，保持2 min，再以每分鐘10℃的速率升溫至230℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度為230℃；檢測器溫度為250℃；分流進(jìn)樣，分流比為50∶1。分別吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各1 μL，注入氣相色譜儀。供試品色譜中應(yīng)呈現(xiàn)與對照品色譜峰保留時間相同的色譜峰，陰性對照無干擾。氣相色譜圖見圖2。

2.3 HPLC法行連翹定量分析

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS3柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（23∶77），流速：1.0 mL/min；檢測波長：277 nm；柱溫為室溫；自動進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL；理論板數(shù)按連翹苷峰計應(yīng)不低于5000，陰性對照無干擾。液相色譜圖見圖3。

2.3.2 溶液的制備

2.3.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取連翹苷對照品19.70 mg，置25 mL量瓶中，加70%甲醇定容，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液適量，以70%甲醇為溶劑制成不同質(zhì)量濃度的對照品溶液。該系列的連翹苷對照品溶液的最終質(zhì)量濃度分別為9.387、18.77、37.55、75.10、150.2、300.4 μg/mL。

2.3.2.2 供試品溶液的制備 精密量取本品25 mL，用乙酸乙酯振搖提取6次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加70%甲醇溶解，置10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3.2.3 陰性對照溶液的制備 另取缺連翹的陰性對照制劑25 mL，同法制備陰性對照溶液。

2.3.3 線性關(guān)系考察

取“2.3.2”項下配制的系列對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測定。以質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得連翹苷的回歸方程為Y=456.8X-19.27（r=0.9999，n=6）。結(jié)果表明，連翹苷在9.387～300.4 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 精密度試驗

精密吸取同一對照品溶液（質(zhì)量濃度為75.10 μg/mL），連續(xù)進(jìn)樣6次，連翹苷峰峰面積的RSD為0.82%（n=6），表明精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗

取藍(lán)翹解毒口服液（批號：20130923）25 mL，按“2.3.2”項下方法制備，平行試驗6份。結(jié)果連翹苷的平均含量為97.28 μg/mL，RSD=0.88%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液10 μL，于0、4、8、12、16、24 h分別測定峰面積。結(jié)果，連翹苷峰面積的RSD為1.15%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗

精密量取已知連翹苷含量的樣品（批號：20130923，含量為97.28 μg/mL）9份，分別按低、中、高加入連翹苷對照品，按“2.3.2”項下方法制備，測定峰面積并計算回收率，結(jié)果見表1。

2.3.8 樣品含量測定

取4批藍(lán)翹解毒口服液，按“2.3.2”項下方法制備并測定連翹苷的含量，測定結(jié)果見表2。

3 討論

該制劑處方中，板藍(lán)根[2]191苦寒清泄，擅清熱解毒，更擅涼血利咽，直折里熱，連翹[2]159-160性苦微寒，善清降之中兼能升浮宣散，能表里氣血俱清，二者共為君藥，同行清熱解毒，涼血消腫之功；山豆根[2]25-26性苦寒，功專清泄，廣藿香[2]42-43辛散溫運，芳香化濁，兩者一泄一發(fā)，相須為用，更助君藥之力，共為臣藥。根據(jù)《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)（中藥）研究制定技術(shù)要求》[3]，應(yīng)對上述4味藥進(jìn)行定性定量分析。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有針對山豆根和連翹的薄層色譜鑒別，無含量測定，本試驗在其基礎(chǔ)上，擬增加針對板藍(lán)根和廣藿香的定性分析，增加針對連翹的定量分析。

3.1 板藍(lán)根的定性鑒別

現(xiàn)代研究表明，板藍(lán)根化學(xué)成分豐富[4]，抗病毒作用明顯[5-8]，臨床應(yīng)用廣泛[9]。其中，亮氨酸、精氨酸等氨基酸類成分為板藍(lán)根的重要藥理活性成分，含量可達(dá)8%[10]。本試驗通過TLC法對板藍(lán)根進(jìn)行鑒別[11]，方法參照《中國藥典》2010年版一部板藍(lán)根鑒別項下方法進(jìn)行[2]191。原方法對照溶液選用板藍(lán)根對照藥材、精氨酸對照品，本試驗在此基礎(chǔ)上增加了亮氨酸對照品，斑點顯色清晰，色譜分離效果良好，操作方便，專屬性強(qiáng)，可以有效對之進(jìn)行鑒別。

3.2 廣藿香的定性鑒別

廣藿香的藥用成分主要是揮發(fā)油，廣藿香油中含有較多的醇類、酮類、醛類等化合物，其中百秋李醇是其代表性活性成分[12-13]。本試驗通過GC法檢測制劑中的百秋李醇[14]，從而對廣藿香進(jìn)行鑒別。試驗中，首先通過揮發(fā)油測定法制備揮發(fā)油，然后通過GC法鑒別揮發(fā)油中的有效成分百秋李醇。GC法檢測靈敏度高，專屬性強(qiáng)，可以有效地對廣藿香進(jìn)行鑒別。

3.3 連翹苷的定量分析

連翹苷為連翹的主要有效成分之一[15]，結(jié)合文獻(xiàn)報道[16-17]，本試驗采用HPLC法測定制劑中連翹苷的含量。

制備供試品溶液時，通過乙酸乙酯萃取，可以有效除去制劑中的干擾成分，提高連翹苷的提取率。測定波長、流動相、提取溶劑均參照《中國藥典》2010年版一部[2]159-160。選擇色譜柱時，考察了Agilent zorbax extend C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Shimadzu VP-ODS色譜（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Inertsil ODS3（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil KR100-5-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）等4種色譜柱，結(jié)果表明4種色譜柱的峰形、理論板數(shù)、分離度均良好，無顯著性差異，最終選擇Inertsil ODS3（250 mm×4.6 mm，5 μm）進(jìn)行方法學(xué)考察和樣品含量測定。

根據(jù)《中國藥典》中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則的要求[2]附錄130-131，含量限（幅）度的制訂，應(yīng)根據(jù)投料飲片、中間體轉(zhuǎn)移率的實際情況確定。本次測定了4批藍(lán)翹解毒口服液中連翹苷的含量，其值分別為90.06、82.94、85.24、97.28 μg/mL，平均值為88.88 μg/mL，上述數(shù)據(jù)為藍(lán)翹解毒口服液中連翹苷的含量限度的確定提供了參考。HPLC法測定結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定性好，專屬性強(qiáng)，可以有效測定制劑中連翹苷的含量。

綜上所述，本試驗對藍(lán)翹解毒口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了提高，其中TLC法鑒別板藍(lán)根操作方便、專屬性強(qiáng)，GC法鑒別廣藿香靈敏度高、專屬性強(qiáng)，HPLC法測定連翹苷的含量結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好，可以用于藍(lán)翹解毒口服液的質(zhì)量控制。因此，可將板藍(lán)根的TLC鑒別、廣藿香的GC鑒別、連翹苷的含量測定列入藍(lán)翹解毒口服液的原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，從而對其進(jìn)行提高。

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（收稿日期：2014-10-03 本文編輯：衛(wèi) 軻）