化學(xué)發(fā)光免疫分析法研究進(jìn)展

陸龍飛　葛勝祥　張　軍

化學(xué)發(fā)光免疫分析法研究進(jìn)展

陸龍飛葛勝祥張軍★

［摘要］化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）是一種高靈敏度高特異性的檢測(cè)分析技術(shù)，具有廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。本文簡(jiǎn)要介紹了化學(xué)發(fā)光免疫分析法的分類、發(fā)展和應(yīng)用，重點(diǎn)從實(shí)際應(yīng)用的角度闡述了化學(xué)發(fā)光在解決低豐度低信噪比、多組分檢測(cè)、高速自動(dòng)化等方面的發(fā)展情況，以及簡(jiǎn)要介紹了新型材料、試劑和技術(shù)應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光體系的進(jìn)展，并對(duì)化學(xué)發(fā)光免疫分析法的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

［關(guān)鍵詞］化學(xué)發(fā)光免疫分析；多組分檢測(cè)；流動(dòng)注射分析；量子點(diǎn)；微流控芯片

作者單位：廈門大學(xué)國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建，廈門361102

Review on the development of chemiluminescence immunoassay

LU Longfei, GE Shengxiang, ZHANG Jun★
(National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Diseases, Xiamen University，Xiamen, Fujian, China, 361102)

[ABSTRACT] Chemiluminescence immunoassay (CLIA) was a widely used technology attribute to its high sensitivity and specificity. The classification, recent advances and the application of chemiluminescence immunoassay were reviewed. This review was focused on the advances of chemiluminescence immunoassay in practical application, especially in improving the signal-to-noise ratio of low abundance samples, multianalyte detection, rapid and automatic detection. In addition, the advances of new materials, reagents and technologies applied in chemiluminescence immunoassay were briefly reviewed．And the development trend of chemiluminescence immunoassay was prospected.

[KEY WORDS] Chemiluminescence immunoassay; Multi-analyte detection; Flow injection analysis; Quantum dot; Microfluidics

1978年Halman等成功建立化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）以來，該方法大致經(jīng)歷了4個(gè)階段的發(fā)展［1］，相繼應(yīng)用了大量新的材料、技術(shù)、工藝和儀器而日趨完善和普及?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合的檢測(cè)分析技術(shù)，通過激發(fā)化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)入激發(fā)態(tài)再回到穩(wěn)定態(tài)并發(fā)射光子的過程，將免疫反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)化為光信號(hào)，進(jìn)而利用光信號(hào)測(cè)量?jī)x器測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度，發(fā)光強(qiáng)度因與待測(cè)物質(zhì)濃度在一定條件下呈線性定量關(guān)系，從而確定待測(cè)物質(zhì)濃度。

1　化學(xué)發(fā)光免疫分析的分類

根據(jù)化學(xué)發(fā)光所用的標(biāo)記物和發(fā)光原理的不同，一般可分為3類：直接化學(xué)發(fā)光免疫分析、酶促化學(xué)發(fā)光免疫分析和電化學(xué)發(fā)光免疫分析。不同于前兩者，電化學(xué)發(fā)光由電啟動(dòng)電極表面的電化學(xué)發(fā)光劑發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生光信號(hào)，常需要共反應(yīng)劑提高發(fā)光效率，如三丙胺（tripropylamine，TPA）作為三聯(lián)吡啶釕（［Rb（bpy）3］2＋）的電子供體共反應(yīng)劑。常用的發(fā)光體系有：吖啶酯類、魯米諾類（luminol）、三聯(lián)吡啶釕類、過氧化草酸酯類（TCPO、DNPO）和強(qiáng)氧化劑高錳酸鉀、Ce（SO4）2等（見表1）。有些發(fā)光劑與氧化劑反應(yīng)緩慢，還需要催化劑和增強(qiáng)劑的作用，提高發(fā)光強(qiáng)度和穩(wěn)定性。

表1　化學(xué)發(fā)光免疫分析的分類和常用體系Table 1 Classification of chemiluminescence immunoassay and systems in common use

2　化學(xué)發(fā)光免疫分析的發(fā)展方向

近年來，隨著化學(xué)發(fā)光免疫分析在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用，對(duì)其各方面要求和需求也發(fā)生了改變，在應(yīng)用了大量新技術(shù)、新材料的基礎(chǔ)上，化學(xué)發(fā)光免疫分析法呈現(xiàn)出高靈敏度、高通量和自動(dòng)化的發(fā)展趨勢(shì)。

2．1高靈敏度檢測(cè)

實(shí)際應(yīng)用中常涉及到樣品豐度低、信噪比低、穩(wěn)定性差和信號(hào)干擾等的問題。為解決化學(xué)發(fā)光免疫分析的實(shí)用性，需要提高其靈敏度和穩(wěn)定性：一方面降低信號(hào)噪音，減少非特異性反應(yīng)信號(hào)和信號(hào)干擾；另一方面增強(qiáng)光信號(hào)，提高信噪比和穩(wěn)定性。

化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)的信號(hào)噪音和信號(hào)干擾的因素主要是發(fā)光體系缺陷和原料試劑特異性的影響。為改善發(fā)光體系缺陷，研發(fā)新的發(fā)光劑、增強(qiáng)劑、發(fā)光體系等［5，9］以及對(duì)于反應(yīng)時(shí)間、孵育時(shí)間、緩沖液的選擇和標(biāo)記抗體濃度等細(xì)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化［10－11］，都是減少信號(hào)噪音干擾的影響因素，也是人們長(zhǎng)期研究的目標(biāo)。原料試劑中，基因工程抗原由于表達(dá)系統(tǒng)、標(biāo)簽融合蛋白的不同而導(dǎo)致修飾折疊的差異，往往對(duì)重組抗原的特異性和靈敏度帶來很大影響。單克隆抗體（monoclonal antibody，Mab）具有很強(qiáng)的免疫反應(yīng)特異性，圍繞Mab的改造，減少無關(guān)結(jié)構(gòu)，提高特異性和活性的研究日益增多，如嵌合抗體、小分子抗體、噬菌體抗體和胞內(nèi)抗體等。因此，如何表達(dá)篩選獲得高特異性和高靈敏度的抗原抗體［12－13］成為人們研究的重點(diǎn)之一。此外采用多種重組抗原或抗體聯(lián)檢［14－15］往往也能起到很好的效果。

除了減少信噪和干擾外，如何增強(qiáng)發(fā)光信號(hào)提高穩(wěn)定性一直是化學(xué)發(fā)光研究的重點(diǎn)，新型納米材料如納米金、碳納米管CNT、碳納米球CNSs、碳納米纖維以及量子點(diǎn)等聯(lián)用到CLIA中，大大提高了CLIA的信號(hào)強(qiáng)度和穩(wěn)定性。電化學(xué)發(fā)光免疫分析中電極表面是電化學(xué)反應(yīng)的關(guān)鍵場(chǎng)所，電極表面的修飾對(duì)于電化學(xué)發(fā)光具有重要作用，對(duì)此人們開展了大量電極修飾的研究，特別是新型納米材料、表面活性劑等［6－8］對(duì)于電化學(xué)發(fā)光影響的研究。近些年，透明電極如氧化銦錫（indium tinoxide，ITO）電極與光導(dǎo)纖維技術(shù)的結(jié)合減少了干擾且更為簡(jiǎn)便，具有很好的應(yīng)用前景。Chen［6］用覆蓋了一層含氟表面活性劑的4 nm的金納米顆粒（GNPs）去修飾ITO電極，形成了FSO-GNP-ITO修飾電極，大大改善了ITO電極用于ECLIA時(shí)TPA氧化率低和ITO表面不穩(wěn)定的問題，提高了發(fā)光的穩(wěn)定性和靈敏度。

量子點(diǎn)QDs具有尺寸可調(diào)的光學(xué)特性和高熒光量子產(chǎn)率，是生物熒光標(biāo)記物的理想光學(xué)材料。但是量子點(diǎn)化學(xué)發(fā)光也存在著自身的缺點(diǎn)，比如QDs-ECL需要高發(fā)光電位，發(fā)光強(qiáng)度低等問題。通過改造量子點(diǎn)比如核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)、摻雜型量子點(diǎn)和單質(zhì)量子點(diǎn)等［16－18］，修飾和改善QDs-ECL體系的發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度和靈敏度，取得了很好的效果。Guo等［19］建立了一個(gè)表面用石墨烯（G）-CdS QDs-瓊脂糖復(fù)合材料修飾的玻璃碳電極（glass carbon electrode，GCE）的CdS QDs-ECL系統(tǒng)，以戊二醛（glutaric dialdehyde，GLD）為交聯(lián)劑結(jié)合抗體，檢測(cè)甲種胎兒球蛋白，石墨烯能大大提高CdS QDs-ECL的檢測(cè)下限和靈敏度。

2．2多項(xiàng)目聯(lián)合檢測(cè)

在臨床應(yīng)用中，常常需要對(duì)復(fù)雜體系的未知樣本進(jìn)行多組分的測(cè)定或者多種指標(biāo)的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)于多組分的檢測(cè)可以大大提高檢測(cè)分析的準(zhǔn)確性和可靠性，減少檢測(cè)分析時(shí)間和繁瑣的人工操作，是免疫分析研究的一個(gè)重要方向。一般靜態(tài)多組分同時(shí)檢測(cè)主要有2種模式：多標(biāo)記物分辨技術(shù)和空間分辨技術(shù)。

多標(biāo)記物分辨技術(shù)以不同的標(biāo)記物標(biāo)記不同的免疫活性物質(zhì)，再通過識(shí)別不同的標(biāo)記信號(hào)來檢測(cè)不同的組分。Qian［20］以兔免疫球蛋白抗原（IgG）和癌胚抗原（carcino-embryonic，CEA）為模型蛋白，將水溶性量子點(diǎn)材料CdS和PbS分別包裹到SiO2納米顆粒上作為探針標(biāo)記到IgG和CEA抗體上，形成”三明治”探針Si／Cd／anti-IgG 和Si／Pb／anti-CEA，經(jīng)夾心法免疫反應(yīng)后，再以方波伏安法（square wave voltammetry，SWV）在-0．57V和－0．81V電壓下分別檢測(cè)探針信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了多標(biāo)記物的同時(shí)檢測(cè)。多色量子點(diǎn)用于CLIA的多組分檢測(cè)是另外一種形式的“多標(biāo)記物”分辨技術(shù)，多色熒光探針具有一元激發(fā)多元發(fā)射的優(yōu)點(diǎn)，能同時(shí)標(biāo)記和跟蹤多個(gè)生物分子事件。Goldman等［21］構(gòu)建了ZnS-CdSe核殼結(jié)構(gòu)的多色量子點(diǎn)標(biāo)記抗體，用夾心免疫法在4種不同波長(zhǎng)下檢測(cè)4種毒素的混合物，顯示多色量子點(diǎn)能夠完成一般有機(jī)染料難以完成的同時(shí)多組分檢測(cè)。但是由于多種信號(hào)的重疊交叉干擾，多標(biāo)記物模式不可避免地涉及到最優(yōu)分析的妥協(xié)。

空間分辨技術(shù)是通過在不同的區(qū)域空間發(fā)生免疫反應(yīng)，再利用陣列檢測(cè)器光電倍增管（photomultiplier tube，PMT）、電荷耦合元件（charge-coupled device，CCD）等同時(shí)測(cè)定大量樣品。Fu［22］設(shè)計(jì)的雙通道流通池，通道Ⅰ標(biāo)記腫瘤標(biāo)志物CA153 和CA125抗體，通道Ⅱ標(biāo)記CA199和CEA抗體，同時(shí)檢測(cè)4種腫瘤標(biāo)志物（圖1）。其將堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和辣根過氧化物（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記到2個(gè)通道的抗體上，再向兩個(gè)通道分別加入相應(yīng)的底物發(fā)光劑（S1和S2）催化兩個(gè)通道的化學(xué)發(fā)光（chemiluminescence，CL）反應(yīng)。當(dāng)用光電倍增管PMT收集其中一個(gè)信號(hào)時(shí)，采取移動(dòng)光柵來遮蔽其他通道進(jìn)行收集。

圖1　通道底物二維空間分辨化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)［22］Figure 1 Channel and substrate zone two-dimensional resolution system for CLIA［22］

傳統(tǒng)的靜態(tài)檢測(cè)方法耗時(shí)較多，流動(dòng)注射分析（flow injection analysis，F(xiàn)IA）結(jié)合化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)形成的動(dòng)態(tài)檢測(cè)方法具有靈敏度高、分析速度快、重復(fù)性好和在線自動(dòng)分析的優(yōu)點(diǎn)，順序注射分析作為FIA分析的一個(gè)重要分支還可以實(shí)現(xiàn)多組分的在線過程分析和同時(shí)檢測(cè)［23－24］。一些具有高效分離檢測(cè)能力的技術(shù)也可以與化學(xué)發(fā)光結(jié)合，如高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、毛細(xì)管電泳法（capillary electrophoresis-chemiluminescence，CE）和微流控芯片（micro-fluidic chip，MFC）［25－28］，形成高自動(dòng)化水平和高分離能力，快速、靈敏的在線多組分分離免疫分析檢測(cè)法。當(dāng)然聯(lián)用體系也存在著自身的缺點(diǎn)，需要優(yōu)化檢測(cè)條件和接口類型等。Huang等［26］構(gòu)建了微型化的FIA-CE-ECL裝置中（圖2），采用落滴型分流接口來解決FIA分流進(jìn)樣與CE的隔離，［Rb（bpy）3］2＋以流動(dòng)的方式不斷加入柱端檢測(cè)區(qū)域，將毛細(xì)管尾端插入到［Rb（bpy）3］2＋流動(dòng)池中實(shí)現(xiàn)［Rb（bpy）3］2＋在毛細(xì)管出口端的電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，再通過光纖經(jīng)PMT檢測(cè)。通過優(yōu)化毛細(xì)管出口和工作電極、光纖的相對(duì)位置獲得很高的靈敏度和分離效率。在68 mm長(zhǎng)的分離毛細(xì)管中，脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸在180 s內(nèi)得到分離檢測(cè)。

微流控芯片分析技術(shù)結(jié)合了CLIA、CE、FIA和微流控的技術(shù)和優(yōu)勢(shì)，具有分析速度快、試劑消耗少和高度自動(dòng)化等特點(diǎn)，包括非均相免疫反應(yīng)和均相免疫反應(yīng)2種反應(yīng)方式。非均相免疫反應(yīng)因具有富集效應(yīng)而擁有更高的靈敏度［29］，而均相免疫反應(yīng)具有更高的分離效率和更短的反應(yīng)時(shí)間，但是由于在線引入發(fā)光劑對(duì)其他通道的干擾以及與發(fā)光劑混合效率較低等因素［27］，實(shí)際應(yīng)用還存在許多問題。Zhao［28］在微芯片電泳系統(tǒng)上完成細(xì)胞注入加載、溶解、電泳分離和發(fā)光檢測(cè)，通過luminol-Na2S2O8體系選擇性地檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的巰基化合物Cys、GSH和血紅蛋白Hb，在120 s內(nèi)完成分離，檢測(cè)下限分別達(dá)到1 amol、32 amol、69 amol。雖然微流控芯片與傳統(tǒng)CE相比靈敏度還不夠理想，但是未來微型化、自動(dòng)化、集成化和便攜化是分析儀器設(shè)備發(fā)展趨勢(shì)，微流控分析芯片作為微全分析系統(tǒng)的重要組成部分之一，還是具有很大的改進(jìn)空間和應(yīng)用前景。

圖2　微型流動(dòng)注射毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)［26］Figure 2　Miniaturized capillary electrophoresis system with flow injection sample introduction and electrogenerated chemiluminescence detection［26］

2．3全自動(dòng)化檢測(cè)

傳統(tǒng)的免疫分析由于免疫物質(zhì)的混合反應(yīng)效率低，檢測(cè)分析的流程冗長(zhǎng)操作繁瑣，因而耗時(shí)較多。為實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，需加速熱力和免疫動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，提高自動(dòng)化水平，聯(lián)用其他技術(shù)減少操作節(jié)約時(shí)間。磁性納米微粒作為載體平臺(tái)，不但可以提高混合和反應(yīng)效率以及靈敏度，利用外加磁場(chǎng)還可以方便快捷的分離結(jié)合相，減少繁瑣的人工操作，為CLIA的全自動(dòng)化發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。Zhang等［30］利用磁微粒（magnetic particles，MP）和包被管的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法（chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA）對(duì)人血清甲種胎兒球蛋白的評(píng)估和分析進(jìn)行了研究比較，MP-CLEIA的線性范圍更廣泛、分析時(shí)間更短、鉤狀效應(yīng)濃度更高，顯示MP-CLEIA對(duì)于篩查檢測(cè)的方便快捷優(yōu)越的優(yōu)點(diǎn)和全自動(dòng)化操作系統(tǒng)的應(yīng)用潛力。

隨著人們對(duì)于檢測(cè)水平和儀器要求的提高，化學(xué)發(fā)光免疫分析提高靈敏度、穩(wěn)定性、檢測(cè)項(xiàng)目以及分析速度等，集成磁微粒、流動(dòng)注射分析、微流控芯片以及機(jī)械電子等的新型自動(dòng)化材料技術(shù)形成智能化、自動(dòng)化、一體化系統(tǒng)是大勢(shì)所趨。未來更高通量的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀器、即時(shí)檢測(cè)［31］儀器、遠(yuǎn)程在線檢測(cè)儀器等將成為相關(guān)的研究熱點(diǎn)之一。表2概述了目前市場(chǎng)上國(guó)內(nèi)外代表性全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析體系。

3　化學(xué)發(fā)光的應(yīng)用與展望

鑒于化學(xué)發(fā)光免疫分析法高靈敏度、寬線性范圍、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，雅培、羅氏、貝克曼等相繼推出了全自動(dòng)檢測(cè)儀器，極大地提高了工作效率和檢測(cè)的準(zhǔn)確度靈敏度，減少人為操作誤差，推動(dòng)了化學(xué)發(fā)光免疫分析法在臨床、食品安全和環(huán)境分析等方面的應(yīng)用。目前在臨床上主要應(yīng)用于激素、腫瘤標(biāo)志物、心肌標(biāo)志物、傳染病等［32－33］的檢測(cè)，為了提高診斷準(zhǔn)確性，減少漏檢等誤差，結(jié)合多種抗原抗體聯(lián)檢取得了良好的效果。第四代雅培的艾滋病毒化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，采用艾滋病毒的P24抗原和HIVI／HIVII型抗體聯(lián)檢，大大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度和靈敏度，有效的減少了漏檢的發(fā)生。

自從20世紀(jì)60年代開始，現(xiàn)代電子技術(shù)和高靈敏度的光電傳感器的發(fā)展，提供了許多研究和測(cè)定化學(xué)發(fā)光的新手段，對(duì)該領(lǐng)域的發(fā)展起到了極大的推動(dòng)作用而迅速發(fā)展。近年來，化學(xué)發(fā)光的發(fā)展主要表現(xiàn)在：（1）化學(xué)發(fā)光使用的試劑以及原料的制備標(biāo)記等研究和發(fā)展；（2）新化學(xué)發(fā)光體系和條件的不斷建立和優(yōu)化；（3）新型納米材料與化學(xué)發(fā)光的結(jié)合應(yīng)用；（4）化學(xué)發(fā)光與其他方法或技術(shù)聯(lián)用，包括流動(dòng)注射技術(shù)、新傳感器技術(shù)、毛細(xì)管電泳分離技術(shù)和微流控技術(shù)等等，拓寬了化學(xué)發(fā)光體系的應(yīng)用范圍；（5）化學(xué)發(fā)光儀器的研究開發(fā)，為化學(xué)發(fā)光的進(jìn)一步發(fā)展創(chuàng)造條件；（6）化學(xué)發(fā)光分析的應(yīng)用范圍擴(kuò)大至各個(gè)領(lǐng)域。因此，可以預(yù)見，化學(xué)發(fā)光免疫分析法將更多的聯(lián)用其他技術(shù)和材料，提高靈敏度和穩(wěn)定性，逐步完善自動(dòng)化、集成化、微型化、智能化和便攜性水平，特別是發(fā)展多組分的全自動(dòng)快速檢測(cè)儀器和POCT儀器，應(yīng)用到更廣泛的領(lǐng)域范圍。

表2　常見的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀器技術(shù)參數(shù)Table 2 Technical parameters of common chemiluminescence immunoassay instruments

參考文獻(xiàn)

[1]李振甲,應(yīng)希堂,馬世俊.化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的研究現(xiàn)狀與展望[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2006,27(1):95-97.

[2]尹東光,賀佑豐,劉一兵,等.幾種主要化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的發(fā)光性能及其化學(xué)發(fā)光免疫分析體系[J].標(biāo)記免疫分析與臨床, 2002，9(4):225-230.

[3]Luo J, Cui X, Liu W, et al. Highly sensitive homogenous chemiluminescence immunoassay using gold nanoparticles as label [J]. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 2014,131:243-248.

[4]He S, Shi W, Zhang X, et al. Beta-cyclodextrins-based inclusion complexes of CoFe(2)O(4) magnetic nanoparticles as catalyst for the luminol chemiluminescence system and their applications in hydrogen peroxide detection[J]. Talanta, 2010, 82(1):377-383.

[5]Nozaki O, Ji XY, Kricka LJ. New enhancers for the chemiluminescent peroxidase-catalyzed chemiluminescent oxidation of pyrogallol and purpurogallin[J]. Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence, 1995, 10(3):151-156.

[6]Chen Z, Zu Y. Gold nanoparticle-modified ITO electrode for electrogenerated chemiluminescence: well-preserved transparency and highly enhanced activity [J]. Langmuir, 2007,23(23):11387-11390.

[7]Liu ZM, Yang HF, Li YF, et al. Core-shell magnetic nanoparticles applied for immobilization of antibody on carbon paste electrode and amperometric immunosensing[J]. Sensors and Actuators B-Chemical, 2006,113(2): 956-962.

[8]Zu Y, Bard AJ. Electrogenerated chemiluminescence. 67.Dependence of light emission of the tris (2,2′) bipyridylruthenium (II)/tripropylamine system on electrode surface hydrophobicity[J]. Anal Chem, 2001,73 (16):3960-3964.

[9]Martin C, Bresnick L, Juo RR, et al. Improved chemiluminescent DNA sequencing[J]. Biotechniques, 1991, 11(1):110-113.

[10]Kaar JL. Lipase activation and stabilization in roomtemperature ionic liquids[J]. Methods Mol Biol, 2011, 679:25-35.

[11]Broeke LJP, van denBruijn VG, deHeijnen JHM, et al. Micellar catalysis for epoxidation reactions[J]. Industrial & Engineering Chemistry Research, 2001,40(23):5240-5245.

[12]Mousli M, Turki I, Kharmachi H, et al. Recombinant single-chain Fv antibody fragment-alkaline phosphatase conjugate: a novel in vitro tool to estimate rabies viral glycoprotein antigen in vaccine manufacture[J]. J Virol Methods, 2007,146(1-2): 246-256.

[13]Brockmann EC, Vehniainen M, Pettersson K. Use of high-capacity surface with oriented recombinant antibody fragments in a 5-min immunoassay for thyroidstimulating hormone[J]. Analytical Biochemistry, 2010, 396(2):242-249.

[14]Holec-Gasior L, Kur J. Toxoplasma gondii: Recombinant GRA5 antigen for detection of immunoglobulin G antibodies using enzyme-linked immunosorbent assay [J]. Experimental Parasitology, 2010,124(3):272-278.

[15]Busse C, Strubel A, Schnitzler P. Combination of native and recombinant cytomegalovirus antigens in a new ELISA for detection of CMV-specific antibodies [J]. J Clin Virol, 2008,43(2):137-141.

[16]Geng J, Jia XD, Zhu JJ.S onochemical selective synthesis of ZnO/CdS core/shell nanostructures and their optical properties[J]. Crystengcomm, 2011,13(1):193-198.

[17]Deng L, Shan Y, Xu JJ, et al. Electrochemiluminescence behaviors of Eu(3+)-doped CdS nanocrystals film in aqueous solution[J]. Nanoscale, 2012,4(3):831-836.

[18]Fan FR, Park S, Zhu Y, et al. Electrogenerated chemiluminescence of partially oxidized highly oriented pyrolytic graphite surfaces and of graphene oxide nanoparticles[J]. J Am Chem Soc, 2009,131(3):937-939.

[19]Guo Z, Hao T, Duan J, et al. Electrochemiluminescence immunosensor based on graphene-CdS quantum dots-agarose composite for the ultrasensitive detection of alpha fetoprotein[J]. Talanta, 2012,89:27-32.

[20]Qian J, Dai HC, Pan XH, et al. Simultaneous detection of dual proteins using quantum dots coated silica nanoparticles as labels[J]. Biosensors & Bioelectronics, 2011,28(1):314-319.

[21]Goldman ER, Clapp AR, Anderson GP, et al. Multiplexed toxin analysis using four colors of quantum dot fluororeagents [J]. Analytical Chemistry, 2004,76(3): 684-688.

[22]Fu Z, Yang Z, Tang J, et al. Channel and substrate zone two-dimensional resolution for chemiluminescent multiplex immunoassay[J]. Anal Chem, 2007,79(19): 7376-7382.

[23]Gomez V, Callao MP. Multicomponent analysis using flow systems[J]. Trac-Trends in Analytical Chemistry, 2007,26(8):767-774.

[24]Liu H, Fu Z, Yang Z, et al. Sampling-resolution strategy for one-way multiplexed immunoassay with sequential chemiluminescent detection[J]. Anal Chem, 2008, 80(14):5654-5659.

[25]Ikeda R, Ichiyama K, Tabuchi, N, et al. Determination of folates by HPLC-chemiluminescence using a ruthenium(II)-cerium(IV) system, and its application to pharmaceutical preparations and supplements[J]. Luminescence, 2014,29(7):824-830.

[26]Huang XJ, Wang SL, Fang ZL. Combination of flow injection with capillary electrophoresis 8. Miniaturized capillary electrophoresis system with flow injection sample introduction and electrogenerated chemiluminescence detection[J]. Analytica Chimica Acta, 2002,456 (2):167-175.

[27]Hashimoto M, Tsukagoshi K, Nakajima R, et al. Microchip capillary electrophoresis using on-line chemiluminescence detection[J]. Journal of Chromatography A, 2000,867(1-2):271-279.

[28]Zhao S, Huang Y, Ye F, et al. Determination of intracellular sulphydryl compounds by microchip electrophoresis with selective chemiluminescence detection [J]. J Chromatogr A, 2010,1217(36):5732-5726.

[29]Wolter A, Niessner R, Seidel M. Detection of escherichia coli O157: H7, salmonella typhimurium, and legionella pneumophila in water using a flow-through chemiluminescence microarray readout system[J]. Analytical Chemistry, 2008,80(15):5854-5863.

[30]Zhang QY, Wang X, Li ZJ, et al. Evaluation of alphafetoprotein (AFP) in human serum by chemiluminescence enzyme immunoassay with magnetic particles and coated tubes as solid phases[J]. Analytica Chimica Acta, 2009,631(2):212-217.

[31]Yazawa Y, Oonishi T, Watanabe K, et al. System-onfluidics immunoassay device integrating wireless radiofrequency-identification sensor chips[J]. J Biosci Bioeng, 2014,118(3): 344-349.

[32]Tong HL, Li J, Wen XY, et al. Clinical value of the combination detection serum tumor markers in cervical cancer[J]. Labeled Immunoassays & Clin Med, 2011, 18(3):160-162.

[33]Ohta H, Takemura M, Furuta N, et al. Clinical significance and problems in HCV measurement—comparison of CLEIA method with PCR method[J]. Rinsho Byori, 2004,52(10): 813-818.

·論著·

通訊作者：★張軍，E-mail：zhangj＠xmu．edu．cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2011AA02A101）