硫酸脫氫表雄酮化學發(fā)光微粒子免疫法定量測定試劑的研制

黃明聰　張曉琍　林光華　翁祖星　孫旭東　葛勝祥　張　軍★

硫酸脫氫表雄酮化學發(fā)光微粒子免疫法定量測定試劑的研制

黃明聰1張曉琍2林光華2翁祖星1孫旭東1葛勝祥3張軍3★

［摘要］目的研制硫酸脫氫表雄酮化學發(fā)光免疫定量檢測試劑。方法利用硫酸脫氫表雄酮人工完全抗原免疫小鼠，通過雜交瘤技術制備特異性抗硫酸脫氫表雄酮單克隆抗體，采用競爭抑制法建立硫酸脫氫表雄酮化學發(fā)光免疫定量檢測試劑。結果篩選獲得了27株穩(wěn)定分泌抗硫酸脫氫表雄酮的單克隆抗體細胞株，建立了化學發(fā)光微粒子免疫法定量測定硫酸脫氫表雄酮的試劑盒雛形，與雅培公司的硫酸脫氫表雄酮定量檢測試劑在檢測臨床標本上的相關系數(shù)r達0．99以上。結論本研究為國產化硫酸脫氫表雄酮化學發(fā)光微粒子免疫法定量測定試劑盒的研發(fā)奠定了基礎。

［關鍵詞］硫酸脫氫表雄酮；化學發(fā)光微粒子免疫法；定量試劑盒

作者單位：1．廈門萬泰凱瑞生物技術有限公司，福建，廈門361022 2．福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗科，福建，福州350001 3．廈門大學國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心，福建，廈門361102

注：黃明聰和張曉琍為并列第一作者

Development of chemiluminescent microparticle immunoassay for quantitative determination of dehydroepiandrosterone sulfate

HUANG Mingcong1, ZHANG Xiaoli2, LIN Guanghua2, WENG Zuxing1, SUN Xudong1, GE Shengxiang3, ZHANG Jun3★
(1. Xiamen Innodx Biotech Co., Ltd, Xiamen, Fujian, China, 361022; 2. Clinical Laboratory Department, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou, Fujian, China, 350001; 3. National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Disease, Xiamen University，Xiamen, Fujian, China, 361102)

[ABSTRACT]Objective To develop chemiluminescent microparticle immunoassay for quantitative determination of dehydroepiandrosterone sulfate. Methods Mice were immunized by dehydroepiandrosterone sulfate artificial complete antigen.Monoclonal antibodies against dehydroepiandrosterone sulfate were prepared by hybridoma technique.Chemiluminescent microparticle immunoassay for quantitative determination of dehydroepiandrosterone sulfate was developed based on competitive binding method.Results27 monoclonal antibodies were obtained. Chemiluminescent microparticle immunoassay for quantitative determination of dehydroepiandrosterone sulfate prototype kit was established. The coefficient r of testing specimens with reagent from Abbott company was over 0．99. Conclusion Development of domestic chemiluminescent microparticle immunoassay for quantitative determination of dehydroepiandrosterone sulfate reagent was laid foundation by this study.

[KEY WORDS]Dehydroepiandrosterone sulfate; Chemiluminescent microparticle immunoassay; Quantitative determination kit

硫酸脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone sulfate，DHEAs）是脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）的硫酸酯形式，是一種主要由腎上腺皮質分泌的甾醇類激素［1－2］。作為雄性激素和雌性激素的前體，DHEAs是人體中含量最豐富的甾醇類物質，在人血清中的含量比DHEA高250～500倍，比睪酮高100～500倍，比雌二醇高1 000～10 000倍［3－4］。循環(huán)血液中的DHEAs并不具備雄性和雌性激素的生物學活性，運送到靶組織后經脫硫酸化生成DHEA，進而轉變?yōu)椴煌男坌院痛菩约に鼗衔?，發(fā)揮生物學功能。在臨床上，DHEAs的定量檢測常用于多毛癥、女性男性化及多囊性卵巢綜合癥的輔助診斷，當發(fā)生腎上腺腫瘤時DHEAs的水平也會異常升高［5－6］。

DHEAs的定量檢測方法主要有液相色譜-質譜聯(lián)用法和免疫檢測法［7-8］。液相色譜-質譜法由于其樣品前處理復雜，儀器昂貴，耗時長，其應用受到限制。免疫學檢測方法包括放射免疫法、酶聯(lián)免疫法和化學發(fā)光微粒子免疫法（chemiluminescent microparticle immunoassay，CLIA）。其中CLIA靈敏度高、線性范圍寬、再現(xiàn)性好、易于實現(xiàn)自動化和高通量檢測，已逐漸成為臨床檢測中的主流方法。目前，國內只有羅氏、雅培、西門子和貝克曼等國外大公司的DHEAs CLIA定量檢測試劑上市，價格昂貴，研制國產化的DHEAs化學發(fā)光免疫定量檢測試劑十分必要。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1試劑

人工完全抗原DHEAs-BSA、DHEAs-OVA由本實驗室自行合成，弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自Sigma公司，吖啶酯來自于廈門大學。

1．1．2臨床血清標本

臨床血清標本來源于廈門大學。

1．1．3儀器

Berthold Sirius單管式化學發(fā)光檢測儀為德國Berthold Technologies公司產品；PHOMO全自動酶標儀為安圖生物公司產品。

1．1．4實驗細胞、動物

骨髓瘤細胞Sp2／0-Ag14由本實驗室保存；Balb／c小鼠和F1小鼠均購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。

1．1．5耗材

細胞培養(yǎng)板購自美國Thermo Nunc公司；96孔酶標板購自廈門怡佳美實驗器材有限公司；細胞凍存管為德國Greiner公司產品；磁微粒Dynabeads M-270購自美國Lifetechnologies公司。

1．2方法

1．2．1小鼠免疫

取6～8周齡的Balb／c小鼠，人工完全抗原DHEAs-BSA和佐劑乳化后皮下注射小鼠，初次免疫注射100 μg抗原，加強免疫注射50 μg抗原，免疫間隔周期為3w，加強免疫3針后，眼眶后靜脈叢采血4～6滴，分離血清后檢測血清效價，取效價高的小鼠進行脾臟免疫。

1．2．2單克隆抗體的篩選

小鼠脾臟免疫72 h后取脾臟細胞與骨髓瘤細胞融合，融合5 d～7 d后換液，間接酶聯(lián)免疫吸附試驗和間接競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗篩選陽性克隆，采用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆化。

1．2．3單克隆抗體的制備

取F1小鼠，向腹腔中注射0．5 mL的液體石蠟油；3 d后，向腹腔中注射對數(shù)生長期的雜交瘤細胞約1×106個；7 d～14 d后，抽取腹水，離心取上清。上清經飽和硫酸銨沉淀后用Protein A親和層析柱純化單克隆抗體。

1．2．4磁珠包被

磁微粒用MEST（10 mmol／L MES，pH 6．0，0．05%Tween 20）洗滌2次后加入新配制的EDC活化30 min，用MEST洗滌2次；加入抗體或抗原，37℃反應3 h；用MEST洗滌5次，用含2%酪蛋白的磷酸鹽緩沖液重懸后于4℃保存。

1．2．5吖啶酯標記

取50 μg抗原或抗體加入到600 μL 0．1 mol／L 的PBS（pH 8．0）中，加入5 μL 1 mmol／L吖啶酯，混勻，室溫避光反應1 h；加賴氨酸溶液反應15 min，然后4℃透析至20 mmol／L pH 6．5的PBS中12 h。

1．2．6間接競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗

包被：包被抗原用20 mmol／L的CBS（pH 9．6）稀釋至2 μg／mL，每孔加100 μL，37℃恒溫箱中放置2 h。封閉：取出酶標板，用PBST（20 mmol／L PBS，pH 6．0，0．1%Triton-X100）洗1遍。每孔加入180 μL封閉液，37℃恒溫箱中放置2 h。棄去封閉液，將板拍干。加樣：加入梯度稀釋的血清或細胞上清和梯度稀釋的DHEAs各50 μL，混勻后于37℃恒溫箱中孵育30 min，PBST清洗5遍。加酶標二抗：每孔加入酶標二抗100 μL，于37℃恒溫箱中孵育30 min，PBST清洗5遍。顯色：將混合后加100 μL于孔中，37℃恒溫箱中孵育15 min。終止并讀值：2 mol／L硫酸終止反應，用酶標儀讀值。

1．2．7管式化學發(fā)光免疫分析實驗

1．2．7．1競爭模式一向微孔板中依次加入包被DHEAs-BSA的磁微粒50 μL、梯度稀釋的DHEAs 20 μL和按1∶500稀釋的吖啶酯標記DHEAs單克隆抗體50 μL，水浴37℃反應25 min；用PBST（20 mmol／L PBS，pH 6．0，0．1%Triton-X100）洗4遍；將反應孔中的磁微粒轉移至反應杯中，用單管式化學發(fā)光檢測儀檢測發(fā)光值。

1．2．7．2競爭模式二向微孔板中依次加入50 μL包被DHEAs單克隆抗體的磁微粒，20 μL梯度稀釋的DHEAs，50 μL按1∶500稀釋的吖啶酯標記DHEAs-BSA，水浴37℃反應25 min；用PBST（20 mmol／L PBS，pH 6．0，0．1%Triton-X100）洗4遍；將反應孔中的磁微粒轉移至反應杯中，用單管式化學發(fā)光檢測儀檢測發(fā)光值。

1．2．7．3DHEA對DHEAs定量檢測的干擾向微孔板中依次加入50 μL包被DHEAs單克隆抗體的磁微粒，分別加入20 μL同等濃度的DHEAs、DHEA及DHEAs和DEHA的混合物，50 μL按1∶500稀釋的吖啶酯標記DHEAs-BSA，水浴37℃反應25 min；用PBST（20 mmol／L PBS，pH 6．0，0．1% Triton-X100）洗4遍；將反應孔中的磁微粒轉移至反應杯中，用單管式化學發(fā)光檢測儀檢測發(fā)光值。

2　結果

2．1 DHEAs單克隆抗體的制備

2．1．1小鼠免疫和單克隆抗體篩選小鼠加強免疫3針后，血清效價達1∶2×105以上，間接競爭ELISA的結果顯示免疫血清中存在DHEAs和DHEA特異性抗體（圖1）。選擇效價高的小鼠取脾臟與骨髓瘤細胞融合并進行單克隆抗體的篩選。

結合間接ELISA和間接競爭ELISA篩選DHEAs特異性抗體，獲得了27株穩(wěn)定分泌抗DHEAs抗體的雜交瘤細胞。

2．1．2單抗性質鑒定

27株DHEAs單克隆抗體的效價均在1：1×105以上，均特異性識別DHEAs，不與氫化可的松、甲羥孕酮、β-雌二醇發(fā)生交叉反應，但能結合DHEA（圖2）。其中2D1、3C4兩株單抗對DHEAs的親和力明顯高于對DHEA的親和力，選擇這2株單抗作為試劑建立的原料。

圖2　DHEAs單克隆抗體的競爭抑制性Figure 2 Competitive inhibition ability of DHEAs Mabs

2．2 DHEAs化學發(fā)光免疫定量測定法的建立

2．2．1競爭模式的選擇

分別用DHEAs-BSA抗原和DHEAs單克隆抗體包被磁微粒，并用吖啶酯標記DHEAs-BSA抗原和DHEAs單克隆抗體，以競爭抑制法建立DHEAs的化學發(fā)光免疫測定方法，檢測系列稀釋的DHEAs。用雙對數(shù)法擬合劑量反應曲線，結果顯示2種競爭模式的定量檢測結果與樣品稀釋倍數(shù)均有較好的線性相關，但標記抗體的斜率更優(yōu)（表1）。

表1　標記抗體或抗原模式所建立的CLIA檢測系列稀釋樣品的線性方程Table 1 Linear equation of CLIA test series diluted sample based on antibody or antigen labeled pattern

2．2．2DHEA對DHEAs定量檢測的干擾

在同等濃度下，抗體對DHEAs顯示出更高的親和力（圖3），當DHEAs和DHEA以同等濃度存在時，DHEA并不影響抗體與DHEAs的結合，加上生理條件下DHEAs的濃度是DHEA的250～500倍［3－4］，因此檢測臨床標本時，DHEA對DHEAs定量檢測影響很小。

圖3　DHEA對檢測的干擾Figure 3 Interference of DHEA on detection

2．2．3與國際主流同類產品的初步比較

選取35份不同背景值的臨床血清標本，分別用Abbott DHEAs定量測定試劑盒和本研究建立的DHEAs CLIA法定量測定試劑檢測DHEAs的含量，結果顯示本研究建立的試劑盒與Abbott的試劑盒在檢測臨床血清標本上相關性良好，相關系數(shù)r在0．99以上（圖4）。

圖4　臨床血清標本檢測相關性評價Figure 4 Correlation of measuring specimens

3　討論

決定化學發(fā)光免疫定量測定試劑性能的參數(shù)主要有檢測靈敏度、線性范圍、特異性等。對于小分子半抗原的免疫定量檢測試劑，特異性是影響其檢測準確性的一個重要因素。DHEAs是小分子半抗原物質，外周血中存在著許多結構類似的甾醇類激素化合物，此外還有DHEA在化學結構上與其只相差一個磺酸基，因此，難以獲得DHEAs高特異性抗體。本研究中篩選獲得的單克隆抗體均能特異性地識別DHEAs，與β-雌二醇、甲羥孕酮、氫化可的松這三種甾醇類激素均無交叉反應，且部分抗體對DHEAs的親和力明顯高于DHEA，選用此類抗體使得DHEA對DHEAs的定量檢測影響很小。并且在人血清中DHEAs的含量比DHEA 高250～500倍［3－4］。因此本研究中建立的DHEAs CLIA定量檢測試劑雖然對DHEA有一定的交叉反應，但其對臨床標本的檢測影響很小。

本研究篩選獲得了DHEAs特異性的單克隆抗體，建立了DHEAs化學發(fā)光微粒子免疫檢測法定量檢測雛形試劑盒，初步評價特異性和定量準確性良好。

參考文獻

[1]Van Voorhees EE, Dennis MF, Calhoun PS, et al. Association of DHEA, DHEAS, and cortisol with childhood trauma exposure and posttraumatic stress disorder[J]. International Clinical Psychopharmacology, 2014, 29(1):56.

[2]Van Voorhees EE, Dennis MF, McClernon FJ, et al. The association of dehydroepiandrosterone (DHEA) and DHEA sulfate (DHEAS) with anxiety sensitivity and electronic diary negative affect among smokers with and without posttraumatic stress disorder[J]. Journal of Clinical Psychopharmacology, 2013,33(4):556.

[3]S覬eborg T, Frederiksen H, Fruekilde P, et al. Serum concentrations of DHEA, DHEAS, 17α-hydroxyprogesterone,Δ4-androstenedione and testosterone in children determined by TurboFlow-LC-MS/MS[J]. Clinica Chimica Acta, 2013,419:95-101.

[4]Urbanski HF, Mattison JA, Roth GS, et al. Dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS) as an endocrine marker of aging in calorie restriction studies[J]. Experimental Gerontology, 2013,48(10):1136-1139.

[5]Goodarzi MO, Carmina E, Azziz R. DHEA, DHEAS and PCOS[J]. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2015,145:213-225.

[6]Jiménez MC, Sun Q, Schürks M, et al. Low dehydroepiandrosterone sulfate is associated with increased risk of ischemic stroke among women[J]. Stroke, 2013, 44(7):1784-1789.

[7]Azziz R, Chang WY, Stanczyk FZ, et al. Effect of bilateral oophorectomy on adrenocortical function in women with polycystic ovary syndrome[J]. Fertility and Sterility, 2013,99(2):599-604.

[8]Hildreth KL, Gozansky WS, Jankowski CM, et al. Association of serum dehydroepiandrosterone sulfate and cognition in older adults: Sex steroid, inflammatory, and metabolic mechanisms[J]. Neuropsychology, 2013, 27(3): 356.

通訊作者：★張軍，E-mail：zhangj＠xmu．edu．cn

基金項目：國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）（2011AA02A101）