總前列腺特異性抗原定量測定試劑盒（化學發(fā)光免疫分析法）的性能驗證

方婉仙　李志雄　董志寧　李　明　吳英松★

總前列腺特異性抗原定量測定試劑盒（化學發(fā)光免疫分析法）的性能驗證

方婉仙1李志雄1董志寧1李明2吳英松2★

［摘要］目的對自制的總前列腺特異性抗原（total prostate specific antigen，tPSA）定量測定試劑盒（化學發(fā)光免疫分析法）進行性能驗證，判斷自制試劑盒是否滿足產(chǎn)品行業(yè)標準要求。方法參照產(chǎn)品行業(yè)標準要求，對自制試劑盒的準確度、最低檢測限、線性、重復(fù)性、批間差、穩(wěn)定性、配對抗體等克分子反應(yīng)性進行考察。結(jié)果自制試劑盒的最低檢測限為0．0022 ng／mL，線性相關(guān)系數(shù)r＝0．9998，重復(fù)性為2．82%和1．96%，批間差為5．55%，配對抗體等克分子反應(yīng)小于15%，均符合產(chǎn)品標準的要求。對剛過12個月有效期的產(chǎn)品進行以上項目檢測，也符合產(chǎn)品標準要求，說明效期內(nèi)試劑質(zhì)量穩(wěn)定。結(jié)論自制試劑盒的各項性能指標符合行業(yè)標準要求，在線性、最低檢測限和檢測范圍方面比臨床常用的羅氏tPSA電化學發(fā)光試劑盒更優(yōu)，可替代國外昂貴試劑應(yīng)用于臨床檢測。

［關(guān)鍵詞］總前列腺特異性抗原（tPSA）；化學發(fā)光免疫分析法（CLIA）；性能驗證

作者單位：1．廣州市達瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣東，廣州510665 2．南方醫(yī)科大學生物技術(shù)學院，廣東，廣州510515

The verification of the performance of total prostate specific antigen (tPSA) quantitative diagnostic kit (chemiluminescent immunoassay)

FANG Wanxian1, LI Zhixiong1, DONG Zhining1, LI Ming2, WU Yingsong2★
(1. Darui Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Guangdong, China, 510665; 2. School of Biotechnology, Southern Medical University, Guangzhou, Guangdong, China, 510515)

[ABSTRACT]ObjectiveTo verify the performance of total prostate specific antigen (tPSA) quantitative diagnostic kit (CLIA) in order to know whether the kit is fit for industrial standard.Methods Refering to tPSA quantitative diagnostic kit (CLIA) industrial standard, the kit accuracy, sensitivity, linearity, repeatability, precision between different assays, stability and equal gram molecular reaction of matching antibodies were studied. ResultsThe sensitivity of the kit was 0.0022 ng/mL．The linear coefficient (r) was 0.9998．Repeatability were 2.82% and 1.96%．And the precision between different assays was 5.55%．Equal gram molecular reaction of matching antibodies was less than 15%. All results were in line with the requirements of industrial standard. The same analysis was performed with the kits which were one month over the expiration date and all the analysis results were in line with industrial standard.ConclusionAll analytic performance results of the kit meet industrial standard.The detection index of linearity, detection limit, detection range are better than that of the tPSA kit from Roche, which can replace foreign expensive reagent for clinical testing and basic medical researh.

[KEY WORDS]Total prostate specific antigen (tPSA); Chemiluminescent immunoassay(CLIA); Performance verification

當前，人口老齡化日益加劇，前列腺疾病患者數(shù)量不斷增長，其中前列腺癌已成為嚴重危害人類健康的主要疾病之一［1］，如何及時正確診斷該類疾病是目前臨床與醫(yī)藥科學研究的熱點。前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）是一種含有237個氨基酸、側(cè)鏈含有7%～8%碳水化合物且具有糜蛋白酶樣活性的絲氨酸蛋白酶，其分子量約為30 000道爾頓。在正常、存在良性增生和惡性前列腺組織的男性血清中均可以檢測出PSA，但在沒有前列腺組織（如：由于根治性前列腺切除術(shù)或膀胱前列腺切除術(shù)）的男性血清或大多數(shù)女性血清中不能檢測出PSA。故PSA成為監(jiān)視前列腺癌男性病人的合適標志。研究表明［2－3］總前列腺特異性抗原（total prostate specific antigen，tPSA）是診斷前列腺疾病特異性最強的血清學指標。而PSA在監(jiān)測患者術(shù)后或藥物治療后前列腺癌轉(zhuǎn)移或病情遷延也有重要價值。目前，我國大部分大醫(yī)院用進口化學發(fā)光法試劑盒進行測定，如羅氏、雅培、西門子等外國公司［4－5］的試劑，但價格昂貴，患者負擔沉重。本研究應(yīng)用磁珠為載體，采用雙抗體夾心免疫分析法將高靈敏度的化學發(fā)光體系和高特異性的免疫反應(yīng)結(jié)合，配合國產(chǎn)全自動化學發(fā)光儀，定量測定人血清或血漿中的tPSA含量［6］。該分析體系穩(wěn)定可靠，成功實現(xiàn)化學發(fā)光tPSA體外診斷試劑的國產(chǎn)化，在臨床上輔助診斷及監(jiān)測前列腺癌等方面具有很高的應(yīng)用價值。

1　材料與方法

1．1材料與試劑

檢測試劑：總前列腺特異性抗原定量測定試劑盒（化學發(fā)光免疫分析法），廣州市達瑞生物技術(shù)股份有限公司制備。校準品：總前列腺特異性抗原校準品，廣州市達瑞生物技術(shù)股份有限公司制備。質(zhì)控品：Lyphochek Tumor Marker Plus Control，來源于Bio-Rad公司。溯源性參考物質(zhì)：世界衛(wèi)生組織tPSA國際標準品，來源于英國國家生物標準與檢定所。游離PSA：世界衛(wèi)生組織游離前列腺特異性抗原（free prostate specific antigen，fPSA）國際標準品，來源于英國國家生物標準與檢定所。

1．2儀器

全自動化學發(fā)光免疫分析儀，型號：Caris200，來源于廈門優(yōu)邁科醫(yī)學儀器有限公司。

1．3參考法規(guī)及標準

行業(yè)標準：《總前列腺特異性抗原（tPSA）定量測定試劑（盒）（化學發(fā)光免疫分析法）YY／T 1163-2009》。

1．4實驗方法

1．4．1試劑盒定標與質(zhì)量控制

試劑盒在使用前均需要用校準品進行標準曲線定標，同時測定第三方Bio-Rad質(zhì)控品進行質(zhì)量控制。

1．4．2準確度

以濃度為40 ng／mL國際標準品tPSA（NIBSC code：96／670）作為樣本檢測5次，測得的平均濃度記為M，根據(jù)公式測量偏差＝（M-理論值）／理論值×100%，行業(yè)標準要求其測量結(jié)果相對偏差應(yīng)在±10%范圍內(nèi)。

1．4．3最低檢測限

用零濃度校準品作為樣本進行檢測，重復(fù)測定20次，得出20次測量結(jié)果的RLU（relative light unit）值，計算其平均值（mean，M）和標準差（standard deviation，SD），得出M＋2SD，根據(jù)零濃度校準品和相鄰校準品之間的濃度-相對發(fā)光值（relative light unit，RLU）值結(jié)果進行兩點回歸擬合得出一次方程，將M＋2SD的RLU值帶入上述方程中，得到的最低檢測限，行業(yè)標準要求結(jié)果應(yīng)不高于0．1 ng／mL。

1．4．4線性

將濃度為100ng／mL的高值樣本按一定比例稀釋為5個濃度，其中低值濃度樣本須接近線性范圍下限。每一濃度樣本重復(fù)測試2次，計算其平均值，通過四參數(shù)擬合線性，行業(yè)標準要求試劑盒的相關(guān)系數(shù)（correlation coefficient，r）應(yīng)不低于0．9900。

1．4．5重復(fù)性

用濃度分別為4 ng／mL±0．8 ng／mL和30 ng／mL±6 ng／mL的樣本各重復(fù)檢測10次，計算10次測量結(jié)果的平均值M和標準差SD，根據(jù)公式CV＝SD／M均值有限公得出其變異系數(shù)（variable coefficient，CV），行業(yè)標準要求應(yīng)不大于10．0%。

1．4．6批間差

用3個不同批號試劑盒檢測同一樣本30 ng／mL±6 ng／mL范圍內(nèi)的樣本，重復(fù)檢測10次，計算30次測量結(jié)果的M和SD，根據(jù)公式CV＝SD／M×100%得出CV，3個批號試劑盒之間的批間CV應(yīng)符合行業(yè)標準要求，不大于15．0%。

1．4．7穩(wěn)定性

在2℃～8℃條件下，保存至有效期后1個月，按照1．4．2～1．4．6的方法進行檢測，結(jié)果需符合相應(yīng)要求。

1．4．8配對抗體的等克分子反應(yīng)性

配制tPSA濃度為10．0 ng／mL而fPSA比例不同的系列樣本（見表1），分別平行測定各樣本的濃度，取測定結(jié)果平均值記為M，根據(jù)公式：測量偏差＝（M－理論值）／理論值×100%，其測量結(jié)果的相對偏差應(yīng)符合行業(yè)標準要求，在±15%范圍內(nèi)。

表1　等克分子反應(yīng)性樣本配制表Table 1 Sample preparation of equal gram molecular reaction

2　結(jié)果

2．1試劑盒定標與質(zhì)量控制

第三方質(zhì)控測量結(jié)果均在質(zhì)控所標示的范圍內(nèi)（見表2），實驗準確可靠。

表2　Lyphochek Tumor Marker Plus Control測量結(jié)果Table 2 Measurement results of Lyphochek Tumor Marker Plus Control

2．2準確度

試劑盒對稀釋成40．0ng／mL的tPSA國際標準品進行檢測，其相對標準偏差為3．85%，試劑盒準確度良好（見表3）。

表3　準確度測量結(jié)果（x±s）Table 3 Measurement results of accuracy（x±s）

2．3最低檢測限

試劑盒對tPSA零濃度標準品檢測，其最低檢出量為0．0022 ng／mL，遠遠低于標準規(guī)定的0．1 ng／mL（見表4）。

表4　最低檢測限檢測結(jié)果（x±s）Table 4　Measurement results of sensitivity（x±s）

2．4線性

將稀釋好的5個濃度樣本進行檢測，將測量結(jié)果通過四參數(shù)擬合線性，線性方程為Y＝（63．75－732488053．74）／（1＋（X／28037．19）0．88）＋732488053．74，其相關(guān)系數(shù)r為0．9998，線性良好（見表5和圖1）。

表5　tPSA線性檢測結(jié)果Table 5 Measurement results of linearity of tPSA

圖1　tPSA線性擬合Figure 1　linear fitting of tPSA

2．5重復(fù)性

濃度分別為4 ng／mL±0．8 ng／mL和30 ng／mL±6ng／mL的樣本，其變異系數(shù)CV%分別為2．82%和1．96%，均不大于10．0%（見表6）。

表6　重復(fù)性檢測結(jié)果（x±s）Table 6 Measurement results of repeatability（x±s）

2．6批間差

用3個批次試劑盒測定30 ng／mL±6 ng／mL范圍內(nèi)的樣本，其變異系數(shù)CV%為5．55%，符合標準要求（見表7）。

表7　批間差檢測結(jié)果（x±s）Table 7　Measurement results of precision between different assays（x±s）

2．7穩(wěn)定性

結(jié)果顯示，所有項目均符合標準要求，說明在1個月有效期內(nèi)，檢測性能未發(fā)生變化，線性關(guān)系良好，且標準品A點發(fā)光值未見明顯升高（見表8）。

2．8配對抗體的等克分子反應(yīng)性

試劑盒檢測根據(jù)表1配制tPSA濃度為10．0 ng／mL而fPSA比例不同的系列樣本，其測量結(jié)果均在±15%范圍內(nèi)（見表9）。

3　討論

試劑盒性能的好壞直接關(guān)系到試劑盒的臨床使用性能。本研究著重驗證自制的總前列腺特異性抗原定量測定試劑盒（化學發(fā)光免疫分析法）的分析性能。自制試劑盒用吖啶酯作為標記物，其化學反應(yīng)簡單、快速、無須催化劑；非特異性結(jié)合少，本底低；與大分子的結(jié)合不會減小所產(chǎn)生的光量，從而增加靈敏度。實驗結(jié)果中充分體現(xiàn)這一特點，試劑盒其最低檢測限為0．0022 ng／mL，結(jié)果非常突出，靈敏度和精確度比酶免法、熒光法高幾個數(shù)量級，可替代放射免疫分析。與國內(nèi)外市場占有率較高的羅氏tPSA試劑盒進行比對，羅氏tPSA試劑盒最低檢測限為0．003 ng／mL，自制試劑盒靈敏度更高。自制試劑盒準確度良好，檢測結(jié)果相對標準偏差為3．85%，在線性范圍為0．1 ng／mL～100 ng／mL內(nèi)相關(guān)系數(shù)r為0．9998，而羅氏tPSA試劑盒在0．1 ng／mL～50 ng／mL內(nèi)相關(guān)系數(shù)r為0．898，自制試劑盒線性更優(yōu)。自制試劑盒檢測范圍為0．0022 ng／mL～100 ng／mL，比羅氏tPSA試劑盒檢測范圍0．003 ng／mL～100 ng／mL略廣。配對抗體的等克分子反應(yīng)性檢測表明試劑盒對PSA和PSA-ACT的識別是等量的。對過期1個月的試劑盒進行檢測，試劑盒的性能仍然符合標準要求，試劑盒的穩(wěn)定性較好。相對于羅氏tPSA試劑昂貴的價格，自制試劑盒價格便宜，能更好地在臨床應(yīng)用中降低醫(yī)療成本，減輕患者負擔，提高醫(yī)療服務(wù)質(zhì)量。

目前，全國批準上市的國產(chǎn)tPSA檢測試劑盒種有16種，進口同類型tPSA檢測試劑盒有7種，tPSA試劑盒檢測方法也不盡相同，其中有放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附法、時間分辨熒光免疫分析法、膠乳增強免疫比濁法、流式熒光免疫法、膠體金法、微磁粒分離酶聯(lián)免疫法等，其中接近30%的試劑盒應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法，但都存在某些缺點，如熒光背景突光、熒光淬滅、放射性廢物、靈敏度不佳、測定范圍有限、標記物穩(wěn)定性差等［7－8］。而化學發(fā)光免疫分析技術(shù)將具有高靈敏度的化學發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合，已經(jīng)成為一種成熟的、先進的超微量活性物質(zhì)檢測技術(shù)，應(yīng)用范圍廣泛，近10年發(fā)展迅猛，是目前發(fā)展和推廣應(yīng)用最快的免疫分析方法，也是目前最先進的標記免疫測定技術(shù)，主要具有靈敏度高、特異性強、試劑價格低廉、試劑穩(wěn)定且有效期（6個月～18個月）、方法穩(wěn)定快速、檢測范圍寬、操作簡單自動化程度高等優(yōu)點［9－10］，受到廣大科研工作者和臨床分析工作者的青睞，顯示了該技術(shù)將在現(xiàn)在及未來的免疫分析檢測領(lǐng)域極其重要的作用。

綜上所述，自制的總前列腺特異性抗原定量測定試劑盒（化學發(fā)光免疫分析法）各項性能均遠遠超出《總前列腺特異性抗原（tPSA）定量測定試劑（盒）（化學發(fā)光免疫分析法）YY／T 1163－2009》規(guī)定的要求，具有非常好的分析性能，與目前臨床廣為應(yīng)用的進口試劑盒羅氏tPSA試劑盒在線性、檢測限和檢測范圍更優(yōu)，自制試劑盒所需樣本量少、操作流程簡單、無放射性危害、成本較進口試劑盒經(jīng)濟，因此能更好地滿足臨床檢測的需要，并對tPSA檢測的應(yīng)用推廣、國產(chǎn)化，并打破國外試劑的壟斷具有重要意義。

表8　有效期后一個月的試劑盒分析性能評估的結(jié)果總結(jié)Table 8 Summarizes the results of performance of the kits which were one month over the expiration date

表9　配對抗體的等克分子反應(yīng)性（x±s）Table 9　Measurement results of equal gram molecular reaction of matching antibodies（x±s）

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通訊作者：★吳英松，E-mail：yingsongwu＠hotmail．com

基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）2011AA02A101