多年生黑麥草花粉活力和柱頭可授性1)

翟飛飛 巨關(guān)升 李偉 劉俊祥 韓蕾 孫振元

(中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京，100091)

多年生黑麥草花粉活力和柱頭可授性1)

翟飛飛 巨關(guān)升 李偉 劉俊祥 韓蕾 孫振元

(中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京，100091)

以多年生黑麥草(Loliumperenne)品種‘Pinnacle’為材料，用TTC染色法和花粉管體外萌發(fā)法測(cè)定花粉在4種貯藏條件下(4 ℃常態(tài)、4 ℃干燥、-20 ℃常態(tài)和-20 ℃干燥)的活力變化；采用聯(lián)苯胺—過氧化氫法測(cè)定開花前和開花后不同時(shí)段的柱頭可授性。結(jié)果表明：多年生黑麥草花粉不耐貯藏，相比較而言，4 ℃干燥有利于其保存，7 d后花粉活力可維持在5%左右；而柱頭可授性在開花前1 d至開花后5 h較強(qiáng)，該時(shí)間內(nèi)授粉有利于受精作用，可提高結(jié)實(shí)率。

多年生黑麥草；花粉活力；柱頭活性；TTC染色；花粉管體外萌發(fā)

WithLoliumperennecommercial variety ‘Pinnacle’, we used TTC staining method and pollen tube germination method in vitro to measure pollen viability under four storage conditions of 4 ℃ and room humidity, 4 ℃ and dry condition, -20 ℃ and room humidity, and -20 ℃ and dry condition. And we used benzidine-hydrogen peroxide method to study stigma. The pollen ofLoliumperennewas not resistant to storage, and 4 ℃ with dry condition was beneficial to its conserve relatively. Pollen viability maintained about 5% after 7 d. Stigma receptivity was strong between 1 d before blooming and 5 h after blooming, and this period was beneficial to fertilization and enhancing fruiting rate of flowers.

多年生黑麥草是禾本科黑麥草屬的多年生草本植物，是一種重要的冷季型草坪草，其株型美觀、建坪速度快、耐踐踏，廣泛用于運(yùn)動(dòng)場(chǎng)和高爾夫球場(chǎng)[1]。但其存在抗寒、抗熱性差[2-3]，對(duì)水分要求高[4]等缺點(diǎn)，因此，培育抗性強(qiáng)的多年生黑麥草新品種具有重要意義：一方面可提高其在園林綠化中的運(yùn)用，增加景觀效果，另一方面可緩解國內(nèi)對(duì)國外草種的過分依賴。在種子生產(chǎn)及雜交育種過程中，為了進(jìn)行人工輔助授粉和雜交授粉，通常需要采集和保存花粉，使有活性的花粉到達(dá)適宜的接受柱頭，從而解決花時(shí)和花期不遇問題，提高雜交育種工作成功率。

花粉活力及柱頭可授性因植物種類而異，研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)禾本科植物的花粉活力喪失較快，如水稻花粉在田間條件下3 min內(nèi)即有50%失去活力，5 min內(nèi)幾乎全部喪失；小麥花粉放置5 h，授粉后結(jié)實(shí)率降低到6.4%；高粱花粉采下5 h，再授粉則不能獲得任何種子；玉米花粉的活力在自然條件下僅能維持1～2 d[5-6]。多年生黑麥草是一種疏叢型植物，為異花授粉類型，且自交不親和，目前，未見有關(guān)其花粉活力及柱頭可授性方面的報(bào)道。文中對(duì)多年生黑麥草花粉活力及柱頭可授性進(jìn)行研究，旨在找到適合多年生黑麥草花粉的最佳貯藏條件及柱頭最佳可授期，為以后的雜交育種工作合理有序進(jìn)行提供參考，進(jìn)而培育出多年生黑麥草新種質(zhì)。

1 材料與方法

本試驗(yàn)材料為多年生黑麥草品種‘Pinnacle’。種子于7月16日播種于直徑為10.0 cm的營養(yǎng)缽中，栽培基質(zhì)V(泥炭)∶V(珍珠巖)=6∶1，每盆施0.5 g緩釋肥(Osmocotte，M5-6，質(zhì)量分?jǐn)?shù)w(N)∶w(P)∶w(K)=14∶13∶13)。溫室溫度白天22～25 ℃，晚上16～19 ℃，相對(duì)濕度50%，最大光強(qiáng)為400 μmol·m-1·s-1。每7 d澆1次水。9月15日移栽至中國林業(yè)科學(xué)研究院玉泉山苗圃，并進(jìn)行正常田間養(yǎng)護(hù)管理；第2年5月中旬開花后，取花粉、柱頭進(jìn)行試驗(yàn)。

于盛花期上午09:30—11:30，用鑷子夾取露出穎殼、即將開裂的黃色花藥置于直徑為60 mm的小培養(yǎng)皿中。采集完后放入冰盒，立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理：4 ℃常態(tài)、4 ℃干燥、-20 ℃常態(tài)、-20 ℃干燥。干燥：在直徑為90 mm的大培養(yǎng)皿中放入適量硅膠，將小培養(yǎng)皿置于大培養(yǎng)皿內(nèi)，并用自封袋包裹進(jìn)行干燥處理。常態(tài)：大培養(yǎng)皿內(nèi)不加硅膠，小培養(yǎng)皿置于大培養(yǎng)皿內(nèi)。然后，將干燥和常態(tài)處理的花粉放入冰箱4 ℃和-20 ℃條件下，進(jìn)行不同溫度保存。分別在保存1、2、4、7 d測(cè)定花粉活力。另外，在田間條件下，取下花藥5、10 min和1 h后，分別測(cè)定花粉活力。

花粉活力的測(cè)定：TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)染色法采用高俊鳳[7]的方法。在載玻片上滴一滴0.5% TTC溶液，用解剖針蘸取花藥置于載玻片上的溶液中，將花藥破碎，蓋上蓋玻片，將載玻片置于事先備好的放有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，然后連同培養(yǎng)皿放置于25 ℃的黑暗環(huán)境下培養(yǎng)。25 min后顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)蓋片中央5個(gè)視野中紅色花粉所占比例，計(jì)算平均值并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每種處理材料觀察3個(gè)制片。試劑的配制，即稱取0.50 g TTC放入燒杯中，加入少許95%酒精使其溶解，然后用蒸餾水稀釋至100 mL。溶液避光保存，若發(fā)紅則不能再用。

花粉管體外萌發(fā)法采用胡適宜[8]的方法。首先配制適合花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基，即稱10.0 g蔗糖、0.01 g硼酸(HBO3)、0.03 g硝酸鈣(Ca(NO3)2·4H2O)、0.02 g硫酸鎂(MgSO4·7H2O)，0.01 g硝酸鉀(KNO3)溶解于100 mL蒸餾水中，置于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ玫喂芗觾傻闻囵B(yǎng)液于凹槽培養(yǎng)皿中，用解剖針蘸取花藥置于載玻片上的溶液中，將花藥破碎，蓋上蓋玻片，將載玻片置于事先備好的放有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，然后連同培養(yǎng)皿放置于25 ℃的環(huán)境下，室溫下進(jìn)行孵育，3 h后顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況。每種處理材料觀察3個(gè)制片，蓋片中央選5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)其萌發(fā)率，計(jì)算花粉萌發(fā)百分率。

柱頭可授性的測(cè)定：采用聯(lián)苯胺—過氧化氫法[9]，聯(lián)苯胺—過氧化氫反應(yīng)液為V(1%聯(lián)苯胺溶液)∶V(3%過氧化氫溶液)∶V(水)=4∶11∶22的混合液。在開花盛期，采開花后不同天數(shù)的花朵，將其柱頭浸入含有聯(lián)苯胺—過氧化氫反應(yīng)液的凹面載玻片凹陷處。若柱頭具有可授性，則表現(xiàn)過氧化物酶活性，使周圍的反應(yīng)液呈現(xiàn)藍(lán)色并伴有大量氣泡，反之則無。每天取5～10個(gè)柱頭進(jìn)行測(cè)定，并且在第1天取樣時(shí)標(biāo)記好其他開放的花。試劑的配制為1%聯(lián)苯胺溶液，即稱1.0 g聯(lián)苯胺固體溶于100 mL 50%的酒精溶液，裝入棕色試劑瓶備用；3%過氧化氫，即取10.0 mL 30%的過氧化氫和90.0 mL蒸餾水混合，裝入試劑瓶中備用。反應(yīng)液配好之后放入棕色試劑瓶內(nèi)，并于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

數(shù)據(jù)處理：采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表繪制；應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析和Duncan多重比較檢驗(yàn)不同處理間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 短時(shí)間內(nèi)花粉活力

由表1可知，兩種測(cè)定方法所得結(jié)果較為一致，多年生黑麥草花粉采集5、10 min和1 h，其活性無顯著差異；經(jīng)TTC染色法測(cè)定的花粉活性均比花粉管體外萌發(fā)法高，前者最高為48.68%，后者最高僅為26.19%(表1)?？梢?，多年生黑麥草花粉活力在5 min之內(nèi)喪失較快，具活力花粉的活性可維持一段時(shí)間，且在1 h之內(nèi)變化不顯著。

表1 短時(shí)間內(nèi)花粉活力測(cè)定

注：表中數(shù)據(jù)為15次測(cè)定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；同列相同小寫字母表示同一方法、不同時(shí)間下無顯著差異(P>0.05)。

2.2 不同貯藏條件對(duì)花粉活力的影響

由表2可知，隨著時(shí)間延長，4種貯藏條件下多年生黑麥草花粉活力均下降，且TTC染色法比花粉管體外萌發(fā)法所測(cè)活力高。TTC染色法測(cè)定結(jié)果表明，花粉采集1 d后，-20 ℃(常態(tài)和干燥)下利于花粉活力保持。采集4 d后，4 ℃(常態(tài)和干燥)條件下，花粉活力下降不顯著，而-20 ℃(常態(tài)和干燥)條件下則顯著降低。7 d后，4種條件下花粉活力均顯著下降，以-20 ℃常態(tài)下降幅度最大，為95.99%(相對(duì)于表1中1 h時(shí)花粉活力，下同)，4 ℃干燥下降87.34%；且4 ℃干燥條件的花粉活力顯著高于-20 ℃常態(tài)和-20 ℃干燥，為5.73%(P<0.05)。花粉管體外萌發(fā)法測(cè)定結(jié)果表明，采集2 d后，花粉活力下降不顯著，4 d后僅-20 ℃干燥條件下花粉活力顯著下降。7 d后，4種貯藏條件下的花粉活力均顯著下降，其中-20 ℃(常態(tài)和干燥)下降幅最大，約為90%；4 ℃(常態(tài)和干燥)狀態(tài)下花粉活力顯著高于-20 ℃(常態(tài)和干燥)條件下的，分別為4.98%和5.70%。以上結(jié)果可知，4 ℃常態(tài)較利于多年生黑麥草花粉保存。

2.3 柱頭可授性

由表3可知，多年生黑麥草柱頭在開花前1 d已具較強(qiáng)可授性，即聯(lián)苯胺—過氧化氫法染色顏色深，氣泡數(shù)量多，柱頭分泌大量黏液；開花后1 h柱頭可授性較強(qiáng)，與開花前相當(dāng)；開花后5 h，柱頭分泌黏液減少，染色較深，氣泡較多，可授性減弱；開花后1 d，柱頭可授性明顯降低，染色較深，氣泡少量或較多，黏液分泌較少；開花后2 d，柱頭過氧化氫酶活性減弱至無，已不再具有可授性。由以上結(jié)果可知，多年生黑麥草柱頭在開花前1 d至開花后1 h，具有較強(qiáng)可授性。

表2 不同貯藏條件對(duì)花粉活力的影響

注：表中數(shù)據(jù)為15次測(cè)定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；同行相同小寫字母表示同一測(cè)定方法和同一貯藏條件、不同時(shí)間下無顯著差異(P>0.05)，同行不同小寫字母表示同一測(cè)定方法和同一貯藏條件、不同時(shí)間下有顯著差異(P<0.05)；同列同一測(cè)定方法和同一時(shí)間、不同貯藏條件下相同大寫字母表示無顯著差異(P>0.05)，同列同一測(cè)定方法和同一時(shí)間、不同貯藏條件下不同大寫字母表示有顯著差異(P<0.05)。

表3 多年生黑麥草柱頭可授性測(cè)定

注：顏色變化，+為淺，++為較深，+++為深；氣泡數(shù)量，+為少，++為較多，+++為多；柱頭分泌黏液，+為柱頭分泌黏液，++為柱頭分泌較多黏液，+++為柱頭分泌大量黏液。

3 結(jié)論與討論

植物花粉活力大小、維持時(shí)間長短，既由自身遺傳基因決定，又受環(huán)境因素影響，如溫度、濕度、氣壓等[10]。刺五加的花粉活力可維持4 d，且花粉活力及下降速度受生境條件影響[11]；錦帶花在開花后6 d，仍有15.38%的花粉具有活力[12]；連翹的花粉活力在開花初期不高，隨后逐漸上升，開花第2 d后達(dá)到最高峰，為94.25%[13]；而銀杏的花粉活力在低溫干燥條件下可維持1 a[14]。對(duì)于禾本科植物花粉而言，其活力喪失較快，貯藏條件不同于其他植物，花粉采集后，如何對(duì)花粉進(jìn)行合理有效保存至關(guān)重要。本研究表明，多年生黑麥草花粉活力喪失較快，采下5 min后即有一半以上花粉失活，但是在短期(1 h)內(nèi)活性基本不變；在采集花粉后1～24 h活力又喪失一半，活力喪失較快，還需對(duì)此段時(shí)間內(nèi)花粉活力進(jìn)行研究。多年生黑麥草花粉不耐貯藏，相比較而言，4 ℃干燥條件下花粉活力較高，此貯藏條件有助于提高多年生黑麥草的結(jié)實(shí)率。

TTC染色法是根據(jù)花粉粒呼吸作用強(qiáng)弱判斷花粉活力的，花粉中呼吸酶活性可較準(zhǔn)確反映其活力強(qiáng)弱，同時(shí)氧化還原染料能在呼吸酶作用下染色，所測(cè)花粉活力值較大[15]。成熟花粉具有較強(qiáng)生活力，在適宜條件下便能萌發(fā)和生長，花粉管體外萌發(fā)法是通過培養(yǎng)基培養(yǎng)來判斷其活力的[16]。但是體外萌發(fā)法易受花粉萌發(fā)條件如培養(yǎng)時(shí)間和溫度、營養(yǎng)物質(zhì)、礦質(zhì)元素等的影響[17]，并且培養(yǎng)基和柱頭存在一定差距，故所測(cè)結(jié)果偏低。本研究中，雖然TTC染色法測(cè)得花粉活力高于體外萌發(fā)法，但兩者趨勢(shì)一致，從不同角度反映花粉活力，結(jié)果說服力較強(qiáng)。

柱頭可授期是花朵成熟過程中的一個(gè)重要時(shí)期，在很大程度上影響自花傳粉率、開花不同階段傳粉成功率、各種傳粉者的相對(duì)重要性、雄性和雌性功能之間的相互干擾、不同基因型花粉之間的競爭以及配子體選擇的機(jī)會(huì)等[18]。柱頭可授期因植物不同而有所差異，如甜櫻桃(Cerasusavium)柱頭可授期從開花前1 d開始可持續(xù)5～7 d[19]，梨(Pyruscommunis)開花時(shí)柱頭還沒發(fā)育成熟，開花2 d后柱頭才具有可授性[20]；并且花朵年齡、一天中開花時(shí)間及柱頭分泌物等均影響柱頭可授性[21]。本研究中，多年生黑麥草柱頭可授性持續(xù)時(shí)間較短：開花前1 d至開花后1 h內(nèi)，柱頭具有最強(qiáng)可授性；而在開花5 h內(nèi)，具較強(qiáng)可授性。因此，對(duì)于多年生黑麥草，最佳授粉時(shí)期是在花朵開放后1 h內(nèi)進(jìn)行，最好在5 h內(nèi)完成，這樣可提高授粉成功率。

根據(jù)上述研究結(jié)果，多年生黑麥草開花后，花粉和柱頭在短時(shí)間內(nèi)均具有較強(qiáng)活性，但是多年生黑麥草自交不親和，可能是花粉和柱頭的SI蛋白相互作用，引起胞內(nèi)游離Ca2+質(zhì)量濃度迅速增加，激活了Ca2+依賴蛋白激酶，在蛋白激酶作用下，蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化，一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)之后，激活相關(guān)基因表達(dá)阻止花粉萌發(fā)；引起細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白解聚，柱頭細(xì)胞程序性死亡，最終導(dǎo)致自交不親和[22]。因此，對(duì)多年生黑麥草花粉活力及柱頭可授性進(jìn)行研究，找到適合其花粉的貯藏條件以及最佳柱頭可授期，可為雜交育種提供理論依據(jù)，有利于多年生黑麥草新品種選育。

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Pollen Viability and Stigma Receptivity ofLoliumperenne

Zhai Feifei, Ju Guansheng, Li Wei, Liu Junxiang, Han Lei, Sun Zhenyuan(Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry Sciences, Beijing 100091, P. R. China)/Journal of Northeast Forestry University，2015,43(3)：75-78.

Loliumperenne; Pollen viability; Stigma receptivity; TTC staining method; Pollen tube germination method in vitro

1)國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2011AA100209)。

翟飛飛，女，1987年5月生，中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所、國家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國林業(yè)科學(xué)研究院)，博士研究生。E-mail：lkyzff@163.com 。

韓蕾，中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所、國家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國林業(yè)科學(xué)研究院)，研究員。E-mail：hl04192003@aliyun.com。

2014年8月5日。

S512.5； Q944.42

責(zé)任編輯：任 俐。