澤漆乙酸乙酯萃取物對小鼠經(jīng)口急性毒性1)

孫雪 李明會 張慶 粟楊靜

(西南林業(yè)大學(xué)，昆明，650224) (云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點實驗室(西南林業(yè)大學(xué)))

澤漆(Euphorbia helioscopia)又名五朵云、五燈草、五風(fēng)草等，屬大戟科，全國分布廣泛［1］，性微寒，味苦，有毒［2］，在民間多為全草入藥，有利尿消腫、化痰、散結(jié)、殺蟲止癢之功效［3］。因澤漆具有毒性，其良好的殺鼠活性為植物源滅鼠藥增添了潛力和開發(fā)價值，但目前未見關(guān)于澤漆中毒后，中毒對象的主要生理指標(biāo)變化與臟器損傷情況的文獻報道。本研究對澤漆乙酸乙酯萃取物的GHS 毒性進行了別類劃分，并對其LD50范圍進行初步評估，以點斜法測定其LD50的具體數(shù)值，判斷其滅鼠活性大小。試驗過程中，觀察、記錄澤漆乙酸乙酯萃取物對小鼠的毒副作用。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

澤漆全草采于昆明市，粉碎，備用。試驗用鼠為昆明小鼠遠交系(KM 小鼠封閉群)，購自昆明醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，體質(zhì)量18～22 g。經(jīng)過7 d 開放實驗室的適應(yīng)性飼養(yǎng)，喂食從昆明醫(yī)學(xué)院實驗動物中心購買的標(biāo)準(zhǔn)飼料與自來水。選擇體質(zhì)量不超過全部小鼠的平均體質(zhì)量20%的小鼠進行試驗。試驗小鼠以3%～5%苦味酸標(biāo)記。

1．2 試驗方法

澤漆萃取物制備:澤漆全草經(jīng)45 ℃烘干、粉碎、過40 目篩后以70%乙醇45 ℃恒溫水浴提取。提取液以50 ℃恒溫減壓濃縮，回收溶劑至稠膏狀。濃縮的提取物用2 倍體積的乙酸乙酯萃取4 次，萃取液再以50 ℃恒溫減壓濃縮，回收溶劑至稠膏狀，即得到澤漆的乙酸乙酯萃取物。

澤漆乙酸乙酯萃取物毒性GHS 類別劃分:根據(jù)《化學(xué)品急性經(jīng)口毒性固定劑量試驗方法》對澤漆乙酸乙酯萃取物的LD50范圍進行評估。

預(yù)試驗:在GHS 毒性類別的判斷試驗中，得出LD50的預(yù)計取值范圍是170 ～450 mg·kg-1，屬于危險級別的有毒物。

正式試驗:根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，總選取60 只KM小鼠，其中雌、雄小鼠各30 只［4］。用點斜法測定LD50，以0．8 的等比級數(shù)設(shè)置5 個灌胃劑量組，分別是179．20、224．00、280．00、350．00、437．50 mg·kg-1，每個劑量組灌胃10 只小鼠，雌、雄鼠各5 只，每5 只中選取中毒表現(xiàn)中等的小鼠作為解剖用，每只小鼠一次性灌胃試液體積0．2 mL。同時，另選雌、雄小鼠各5 只組成1 個空白組，一次性灌胃0．2 mL 蒸餾水。各組的雌、雄小鼠均分籠飼養(yǎng)。

1．3 數(shù)據(jù)處理

澤漆乙酸乙酯萃取物L(fēng)D50的計算采用點斜法［5］200-210。

回歸系數(shù)b=(ˉyn-ˉye)/(iR)。

截距a=5-blogLD50。

回歸方程y=a+bx。

死亡率為r 的致死劑量］。

logLDr的標(biāo)準(zhǔn)誤。

logLDr的平均置信區(qū)間

式中:p 是死亡率;y 是死亡率對應(yīng)的概率單位;ˉyn是高半組y 值均數(shù);ˉye是低半組y 值均數(shù);R 是n 與e間相差的組數(shù)距;k 為分組組數(shù);i 是相鄰兩組劑量對數(shù)值差;n 是每組動物數(shù)。

灌胃給藥后對小鼠進行連續(xù)14 d 的觀察，其中，每隔12 h 觀察記錄一次小鼠的行為與死亡數(shù)。小鼠校正死亡率=((試驗組死亡率-對照組死亡率)/(1-空白組小鼠死亡率))。

2 結(jié)果與分析

2．1 乙酸乙酯萃取物灌胃LD50

根據(jù)GHS 類別評價結(jié)果，澤漆乙酸乙酯萃取物的GHS 毒性類別為3 類，對其進行小鼠灌胃LD50測定。同時，根據(jù)點斜法相關(guān)公式，可以計算任意死亡率(r)下乙酸乙酯萃取物的灌胃劑量。以10 只小鼠為一組的試驗出現(xiàn)死亡個體的最低死亡率是10%。因此，將10%死亡率時乙酸乙酯萃取物的劑量(LD10)作為最低致死劑量的估計值。試驗中，高半組y 值均值ˉyn=5．77，低半組y 值均值ˉye=4．16，高、低半組相差的組數(shù)距R=2，分組組數(shù)k=5，相鄰兩組劑量對數(shù)值差i=0．097，每組動物數(shù)n=10。其它相關(guān)數(shù)據(jù)見表1。測定結(jié)果表明，LD50的致死劑量為314．80 mg·kg-1，標(biāo)準(zhǔn)誤為0．027 0，95%置信區(qū)間為(314．80±38．29)mg·kg-1，99%置信區(qū)間為(314．80±50．20)mg·kg-1;LD10的致死劑量為220．53 mg·kg-1，標(biāo)準(zhǔn)誤為0．035 9，95%置信區(qū)間為(220．53±35．61)mg·kg-1，99%置信區(qū)間為(220．53±46．69)mg·kg-1。

表1 澤漆乙酸乙酯萃取物對小鼠灌胃LD50測定的數(shù)據(jù)

2．2 KM 小鼠日食量與體質(zhì)量

采用小鼠個體的平均日食量、試驗期間的平均體質(zhì)量作為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對灌胃組和空白組小鼠間食量與體質(zhì)量進行差異性分析。LD50測定試驗中，灌胃280．00 mg·kg-1以上劑量的試驗組中，雌、雄小鼠的平均日食量與空白組的差異顯著。224 mg·kg-1試驗組中雌鼠的平均日食量與空白組差異顯著。灌胃280 mg·kg-1以上劑量的試驗組中，雌、雄小鼠的平均體質(zhì)量與空白組差異顯著或極顯著(表2)。

表2 KM 小鼠LD50測定試驗組與空白組平均日食量、平均體質(zhì)量的差異性

2．3 KM 小鼠臟器質(zhì)量

根據(jù)LD50可以看出，350．00 mg·kg-1劑量及以上的試驗組雌、雄小鼠的全部臟器系數(shù)均與空白組差異顯著。同時，肝臟、脾臟和肺臟的臟器系數(shù)在低于350．00 mg·kg-1的劑量組中也有表現(xiàn)顯著差異(表3)。

2．4 KM 小鼠中毒表現(xiàn)

GHS 試驗中小鼠灌胃50 mg·kg-1乙酸乙酯萃取物沒有明顯的毒性反應(yīng)，灌胃乙酸乙酯萃取物300 mg·kg-1時，表現(xiàn)出明顯的偏癱、體質(zhì)量和食量下降、伏地不動、行走搖擺、四肢抽搐、經(jīng)?！班袜汀钡拇蜞?或咳嗽)等，并出現(xiàn)死亡。

對GHS 正式試驗的全部小鼠進行解剖觀察時發(fā)現(xiàn):灌胃50 mg·kg-1乙酸乙酯萃取物的小鼠脾臟體積偏大，肝臟顏色較暗。但是，對預(yù)試驗中灌胃300 mg·kg-1乙酸乙酯萃取物的小鼠解剖發(fā)現(xiàn)，其胃部脹大且胃壁布滿血絲，胃腸內(nèi)容物為暗紅色黏稠液體，有明顯的腐臭味。肝臟有明顯的黑斑，肺臟多處出現(xiàn)暗紅色斑點，腎臟表皮容易被剝落，其余沒有肉眼可視病變。

表3 KM 小鼠LD50測定試驗組與空白組臟器質(zhì)量系數(shù)的差異性

LD50測定試驗的小鼠除了表現(xiàn)出與GHS 類別評價試驗中灌胃300 mg·kg-1乙酸乙酯萃取物的小鼠相同的癥狀外，在350．00 mg·kg-1與437．50 mg·kg-1劑量組中還發(fā)現(xiàn)小鼠排泄物的酸臭味比低劑量組及空白組明顯，且小鼠在死亡前出現(xiàn)明顯的食量、體質(zhì)量與體溫下降。同時，在最高劑量組中小鼠的肺臟和肝臟病變更明顯，胃腸道變成暗紅色，心臟局部變黑或出現(xiàn)血管突出明顯。

3 結(jié)論與討論

在乙酸乙酯萃取物L(fēng)D50的測定試驗中，共死亡了26 只小鼠且并沒有發(fā)現(xiàn)雌鼠比雄鼠表現(xiàn)出更明顯的中毒癥狀，或是有更高的死亡率、更快的死亡速度。澤漆乙酸乙酯萃取物的LD50為314．80 mg·kg-1，95%置信區(qū)間為(314．80±38．29)mg·kg-1。

試驗小鼠的中毒癥狀與解剖結(jié)果與生物堿、黃酮類物質(zhì)中毒癥狀有較大的相似性。烏頭類生物堿可以導(dǎo)致呼吸困難，甚至衰竭，可使運動神經(jīng)先興奮后麻痹，然后喪失知覺，常表現(xiàn)運動障礙;山黧豆(Lathyrus sativus)生物堿可使中毒動物表現(xiàn)運動能力衰弱，身軀麻痹，呼吸困難等，同時引起肝、脾、腎腫大，心室充滿暗紅色血液，外觀變暗等病變［5］200-210。結(jié)合澤漆成分大類定性結(jié)果，初步估計澤漆的主要有毒成分可能與生物堿或黃酮類物質(zhì)有關(guān)。

試驗結(jié)果把澤漆乙酸乙酯萃取物GHS 類別劃定為3 類，同時LD50的計算結(jié)果也都顯示澤漆乙酸乙酯萃取物有較好的殺鼠活性。

試驗動物的各項生理生化指標(biāo)，例如:體質(zhì)量、臟器質(zhì)量系數(shù)、血常規(guī)等，通常被用于試驗動物標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)、藥品動物試驗、疾病動物模型研究的主要參考指標(biāo)［6］，飼料配方的變化、取食方式、試驗環(huán)境不同等原因都有可能影響不同批次的KM 小鼠的生物學(xué)指標(biāo)［7-9］，因此，KM 小鼠的相關(guān)試驗更多采用在同等條件下，以同批次試驗動物設(shè)置空白對照組，通過對比試驗組與空白組的差異，說明試驗組動物的變化。本次試驗采用動物生理指標(biāo)中的食量、體質(zhì)量、臟器質(zhì)量系數(shù)對小鼠灌胃澤漆乙酸乙酯萃取物后的生理變化進行了探索。試驗結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取物不僅能夠造成小鼠多器官肉眼可視病變，還能引起食量、體質(zhì)量、臟器質(zhì)量系數(shù)的明顯變化。但是，在試驗當(dāng)中出現(xiàn)了小鼠體質(zhì)量的明顯下降，因此，臟器質(zhì)量系數(shù)的顯著變化有可能是萃取物毒性引起的，也有可能是體質(zhì)量顯著下降引起的假陽性結(jié)果。其中的變化機制與實質(zhì)影響還需要進一步開展生化指標(biāo)檢驗、組織檢驗等研究加以解釋。同時，澤漆乙酸乙酯萃取物對小鼠其他生理生化方面的具體影響也還有待更廣泛深入的研究。

綜上所述，澤漆乙酸乙酯萃取物具有良好的殺鼠活性并具有較好地開發(fā)為植物源滅鼠藥的潛力，有進一步研究與開發(fā)價值。

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