落葉松-青楊葉銹病菌擔(dān)孢子萌發(fā)規(guī)律

龔文強(qiáng) 甕岳太 王淑君 薛煜

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040) (密山市林業(yè)局) (東北林業(yè)大學(xué))

楊樹廣泛分布于北緯30°～72°之間的地區(qū)，因其生長快、易繁殖、用途廣、適應(yīng)性強(qiáng)、輪伐期短而廣受林業(yè)生產(chǎn)單位和城市綠化部門的歡迎。然而，楊樹上發(fā)生的病蟲害不但多而且嚴(yán)重，其中落葉松-青楊葉銹病(Melampsora larici-populina)是一種分布最廣、危害最嚴(yán)重、寄主種類最多、造成損失最大的葉部病害。已見報(bào)道的國家和地區(qū)近40 個(gè)，危害青楊派、黑楊派及其雜交種的多種楊樹;遍布除南極洲以外的各大洲，幾乎有楊樹的地方都可見到它的危害［1-4］。近年來，該病害在東北各地苗圃普遍發(fā)生，在局部地區(qū)危害尤為嚴(yán)重，因此引起了生產(chǎn)和科研部門的普遍重視［5-6］。在發(fā)病嚴(yán)重的苗圃，2 年生實(shí)生苗發(fā)病率可達(dá)100%，病情指數(shù)達(dá)80 ～92，死苗率達(dá)21．5%［7］。國內(nèi)外曾對(duì)該病的病原、致病性及寄主抗病性等方面進(jìn)行了廣泛地研究，進(jìn)入20 世紀(jì)90 年代以后，研究工作主要集中在病原菌致病性及生理分化、寄主抗病性的分子遺傳等方面。裴明浩等［8］對(duì)該菌的春孢子、夏孢子、冬孢子和擔(dān)孢子的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)春孢子萌發(fā)適溫為15～18 ℃，夏孢子萌發(fā)適溫為18 ～20 ℃，冬孢子以13 ～18 ℃為最適，擔(dān)孢子以15 ～18 ℃為最適。郭志青等［9］的研究表明，夏孢子萌發(fā)的最適溫度是20 ℃，在此溫度下2 h 夏孢子就可萌發(fā)生成芽管，24 h 萌發(fā)率最高可達(dá)63．40%，芽管有多核現(xiàn)象。Staples等［10］報(bào)道了夏孢子萌發(fā)狀態(tài)和侵染結(jié)構(gòu)的分化情況。在擔(dān)孢子萌發(fā)方面的研究國內(nèi)外報(bào)道不多，本研究的目的是摸清擔(dān)孢子的越冬情況和適宜萌發(fā)的溫度條件，為該病的流行病學(xué)、預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

標(biāo)本采集地點(diǎn):2013 年秋季在東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)內(nèi)采集落地的罹病楊樹葉子，一部分置室內(nèi)越冬，一部分置室外自然環(huán)境下越冬。

不同溫度下?lián)咦用劝l(fā)試驗(yàn):將2%瓊脂培養(yǎng)基切成2 cm×2 cm 小塊，厚薄均勻適當(dāng)，放在消毒的載玻片上，置于鋪有浸水脫脂棉的滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，載玻片下端用玻璃棒墊起。將長有冬孢子的葉子反壓于皿蓋內(nèi)，將其分別置于5、10、15、20、25、30 ℃溫度下培養(yǎng)，待擔(dān)孢子彈落到2%瓊脂培養(yǎng)基上時(shí)，撤掉樹葉，繼續(xù)觀察擔(dān)孢子萌發(fā)情況，當(dāng)產(chǎn)生次生擔(dān)孢子后，每隔2 h 觀察一次，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，觀察時(shí)，每個(gè)視野隨機(jī)觀察30 組數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

不同光照條件下?lián)咦友抗艿纳L情況:將收集到的擔(dān)孢子分別置于全光、半光、無光3 種條件下，室溫培養(yǎng)，各3 個(gè)重復(fù)，觀察時(shí)，每個(gè)視野隨機(jī)觀察30 組數(shù)據(jù)，計(jì)算芽管長度。

擔(dān)孢子在-10 ℃的萌發(fā)試驗(yàn):為證明已萌發(fā)的擔(dān)孢子經(jīng)晚霜后是否仍有生命力，取罹病葉片，在室溫下做萌發(fā)試驗(yàn)，標(biāo)記培養(yǎng)皿1“-10 ℃”，標(biāo)記培養(yǎng)皿2“室溫”。隨后觀察其萌發(fā)情況，待其萌發(fā)剛產(chǎn)生芽管時(shí)，將培養(yǎng)皿1 置于-10 ℃環(huán)境下，將培養(yǎng)皿2 放在室溫下培養(yǎng)。24 h 后，將培養(yǎng)皿1 取出，重新置于室溫下，24 h 后，再觀察萌發(fā)情況并記錄。培養(yǎng)皿2 仍在室溫下培養(yǎng)，24 h 后觀察萌發(fā)情況。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，各重復(fù)觀察10 個(gè)視野。

室內(nèi)越冬的冬孢子萌發(fā)試驗(yàn):將室內(nèi)越冬的冬孢子放在培養(yǎng)皿內(nèi)做萌發(fā)試驗(yàn)。培養(yǎng)基制作和獲得擔(dān)孢子的方法同不同溫度下?lián)咦用劝l(fā)試驗(yàn)。將培養(yǎng)皿1 直接置于-10 ℃的環(huán)境中48 h 后轉(zhuǎn)入室內(nèi)溫度下繼續(xù)作萌發(fā)試驗(yàn)，24 h 后取出玻片，觀察其萌發(fā)情況。將培養(yǎng)皿2 放置在室溫下直接作萌發(fā)試驗(yàn)，48 h 后觀察期萌發(fā)情況，若擔(dān)孢子不萌發(fā)，再置于-10 ℃下24 h 后取出再轉(zhuǎn)入室溫作萌發(fā)試驗(yàn)。每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，各重復(fù)觀察10 個(gè)視野。

2 結(jié)果與分析

2．1 擔(dān)孢子在不同溫度下的萌發(fā)率

落葉松-青楊葉銹病菌擔(dān)孢子洋梨形，有一個(gè)疣狀突起，擔(dān)孢子萌發(fā)時(shí)首先長出短的芽管，在芽管頂端產(chǎn)生次生擔(dān)孢子，擔(dān)孢子的內(nèi)容物進(jìn)入到次生擔(dān)孢子內(nèi)，次生擔(dān)孢子萌發(fā)產(chǎn)生芽管，有的擔(dān)孢子可產(chǎn)生三生擔(dān)孢子。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，擔(dān)孢子在5 ℃和10℃下不萌發(fā)，但冬孢子可以萌發(fā)，彈射出擔(dān)孢子。擔(dān)孢子在15 ℃時(shí)萌發(fā)率平均可達(dá)60%，擔(dān)孢子芽管不分枝。在剛開始萌發(fā)的6 h 內(nèi)，擔(dān)孢子萌發(fā)率直線上升，以后趨于平緩(表1，圖1A)。20 ℃時(shí)擔(dān)孢子的萌發(fā)率最高，培養(yǎng)12 h 后，平均萌發(fā)率可達(dá)83．42%(表1，圖1B)。由此可見，落葉松楊柵銹菌的擔(dān)孢子萌發(fā)的最適溫度為20 ℃，而每年適溫出現(xiàn)的時(shí)間或早或晚，成為當(dāng)年病害是否嚴(yán)重的關(guān)鍵。如當(dāng)年有利于擔(dān)孢子萌發(fā)的適溫比正常年份晚半個(gè)月，就會(huì)造成夏孢子比往年少一個(gè)世代，病害就會(huì)輕。擔(dān)孢子在25 ℃下萌發(fā)率開始上升較慢，但到后期萌發(fā)率也可達(dá)到71．52%，但擔(dān)孢子的芽管有扭曲的現(xiàn)象(表1，圖1C)。擔(dān)孢子在30 ℃時(shí)萌發(fā)率很低，比20℃時(shí)的萌發(fā)率降低了68．89%，說明30 ℃不適合擔(dān)孢子萌發(fā)，擔(dān)孢子芽管明顯地扭曲變形，是否還有侵染能力，有待做接種試驗(yàn)驗(yàn)證(表1，圖1D)。在自然界中，早春4 月末5 月初，很少有30 ℃的天氣。如出現(xiàn)這種天氣，這一年的病害肯定會(huì)比正常年份輕。

2．2 擔(dān)孢子芽管長度在不同光照下的生長情況

在光照和黑暗交替的條件下，擔(dān)孢子芽管生長隨時(shí)間的推移而生長，最長可達(dá)58 μm，到48 h 后基本停止生長，這意味著擔(dān)孢子在條件適宜的環(huán)境中可保持生長狀態(tài)達(dá)48 h，甚至更長。擔(dān)孢子芽管在全光條件下的生長情況與半光條件下的基本相似，說明全光和半光對(duì)于擔(dān)孢子生長影響不大。在無光條件，擔(dān)孢子芽管長度最長，表明擔(dān)孢子更適合在無光條件下萌發(fā)(表2)。

表1 不同溫度下落葉松-青楊葉銹病菌擔(dān)孢子的萌發(fā)率

圖1 落葉松-青楊葉銹病菌擔(dān)孢子在不同溫度下培養(yǎng)10 h后的萌發(fā)率

表2 不同光照下落葉松-青楊葉銹病菌擔(dān)孢子芽管的生長情況

2．3 -10 ℃對(duì)擔(dān)孢子萌發(fā)的影響

把在室外越冬的冬孢子置室溫下，已萌發(fā)的擔(dān)孢子(圖2A)移入-10 ℃環(huán)境中48 h 后，再放回到室溫，擔(dān)孢子還可繼續(xù)萌發(fā)，這證明寒冷的條件不能影響擔(dān)孢子的萌發(fā)力和生活力，是一種耐寒性相當(dāng)強(qiáng)的孢子。這意味著擔(dān)孢子在早春即使已開始萌發(fā)，遇到晚霜降臨，也不會(huì)影響當(dāng)年擔(dān)孢子的有效侵染，當(dāng)溫度回升后，擔(dān)孢子芽管還會(huì)繼續(xù)萌發(fā)生長(圖2B)。

2．4 室內(nèi)越冬的冬孢子的萌發(fā)特點(diǎn)

室內(nèi)越冬的病葉直接放入-10 ℃下48 h 后，再移至室溫下做萌發(fā)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)冬孢子可以萌發(fā)，產(chǎn)生擔(dān)孢子并大量萌發(fā)，說明冬孢子只要經(jīng)短期的寒冷刺激就可獲得萌發(fā)能力，而且萌發(fā)勢(shì)與經(jīng)過一冬嚴(yán)寒的病葉上的冬孢子無大異(圖2C)。室內(nèi)越冬的病葉在室內(nèi)做萌發(fā)試驗(yàn)48 h 后，取出玻片觀察，冬孢子可以產(chǎn)生擔(dān)孢子，但擔(dān)孢子無萌發(fā)能力，48 h 后也未見萌發(fā)。當(dāng)將室內(nèi)過冬的冬孢子所產(chǎn)生的、未萌發(fā)的擔(dān)孢子置在-10 ℃條件下48 h 后，再轉(zhuǎn)入室內(nèi)做擔(dān)孢子萌發(fā)試驗(yàn)，24 h 后觀察，其擔(dān)孢子萌發(fā)很好(圖2D)。由此可見，寒冷條件對(duì)擔(dān)孢子的萌發(fā)是至關(guān)重要的。此種現(xiàn)象也為林木病理學(xué)的基礎(chǔ)理論增添了新的內(nèi)容，同時(shí)也為該病害的流行學(xué)研究和預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)提供了參考依據(jù)。

圖2 落葉松-青楊葉銹病菌擔(dān)孢子萌發(fā)狀

3 結(jié)論與討論

在不同溫度下的擔(dān)孢子萌發(fā)試驗(yàn)證明，擔(dān)孢子在10 ℃以下時(shí)不萌發(fā)，即使產(chǎn)生次生擔(dān)孢子也無萌發(fā)能力。15 ℃至25 ℃的環(huán)境下長勢(shì)較好，20 ℃時(shí)萌發(fā)率最高，為83．42%。因此，證明早春時(shí)，自然界的溫度只有高于10 ℃時(shí)，擔(dān)孢子才開始萌發(fā)，且在25 ℃以后萌發(fā)率隨著溫度的增高而降低，擔(dān)孢子芽管出現(xiàn)畸型現(xiàn)象。擔(dān)孢子芽管在無光環(huán)境下生長情況要好于半光和全光，擔(dān)孢子的生長速度最快。擔(dān)孢子芽管長度在無光條件下最長，但光對(duì)擔(dān)孢子芽管生長的影響并沒有其他因素那么強(qiáng)烈。

根據(jù)觀察室溫下已萌發(fā)的擔(dān)孢子移入到-10 ℃環(huán)境中，48 h 后再移入室溫，可繼續(xù)生長，說明擔(dān)孢子的芽管和擔(dān)孢子都不會(huì)受突變的寒冷影響，重新置于室溫時(shí)可繼續(xù)萌發(fā)生長。未經(jīng)過室外越冬的冬孢子，置于低溫48 h 后，移入室溫下，能產(chǎn)生大量的擔(dān)孢子且大量萌發(fā)。室內(nèi)越冬的冬孢子在室溫下可以產(chǎn)生擔(dān)孢子，但擔(dān)孢子無萌發(fā)能力;移入冷凍條件下48 h 后，擔(dān)孢子可獲得萌發(fā)能力，在室溫下大量萌發(fā)。這說明擔(dān)孢子是通過冷凍刺激后，才可獲得萌發(fā)能力，其發(fā)生機(jī)理有待今后深入研究。

［1］ 周仲銘，袁毅．楊樹葉銹病的研究概況［J］．北京林學(xué)院學(xué)報(bào)，1985(4):84-102．

［2］ 袁毅．我國楊樹葉銹病菌種類的研究［J］．北京林學(xué)院學(xué)報(bào)，1984(1):48-82．

［3］ 尚衍重，郝俊貞，袁秀英．內(nèi)蒙古的楊樹柵銹菌［J］．華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1990，5(2):86-92．

［4］ Pei M H，McCracken A R． Rust diseases of willow and poplar［M］． New York:Oxford University Press，2005．

［5］ Hansen E A． Poplar woody biomass yields:a look to the future［J］． Biomass Bioenerg，1991，1(1):1-7．

［6］ Steenackers J，Steenackers M，SteenaekersV，et al． PoPlar diseases，consequences on growth and wood quality［J］． Biomass Bioenerg，1996，10(5/6):267-274．

［7］ 王純利．新疆楊柳科植物上柵銹菌屬(Melampsora Cast．)研究［D］．烏魯木齊:烏魯木齊八一農(nóng)學(xué)院，1985．

［8］ 裴明浩，尚衍重．青楊葉銹病(Melamapsora laricipopulina Kleb．)的研究［J］．東北林學(xué)院學(xué)報(bào)1984，12(2):40-49．

［9］ 郭志青，曹支敏，余仲東．落葉松-楊柵銹菌夏抱子萌發(fā)條件研究［J］．西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，25(3):118-121．

［10］ Staples R C，Macko V． Germination of urediospores and differentiation of infection structures［M］Bushnell W R，Roelfs A P．The cereal rusts，origins，specificity，structure，and physiology．Orlando:Academic Press，1984:255-289．