去甲基阿奇霉素羥基選擇性保護的研究

趙伯龍，張萍

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川 750101)

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去甲基阿奇霉素羥基選擇性保護的研究

趙伯龍，張萍*

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川 750101)

為解決去甲基阿奇霉素活性羥基的反應(yīng)選擇性問題，采用丙酮與鄰苯二甲酸酐對去甲基阿奇霉素進行兩次鄰位保護的方法，得到4”-羥基具有反應(yīng)活性的保護去甲基阿奇霉素，反應(yīng)摩爾收率87.9%。本研究產(chǎn)物可直接用于泰拉霉素的合成，實現(xiàn)了對去甲基阿奇霉素的選擇性保護。

去甲基阿奇霉素；丙酮；鄰苯二甲酸酐；泰拉霉素A

泰拉菌素[1](結(jié)構(gòu)見圖1)是第四代紅霉素類抗生素，主要用于治療放線桿菌、支原體、巴氏桿菌、副嗜血桿菌引起的豬、牛的呼吸系統(tǒng)疾病[2]。去甲基阿奇霉素(結(jié)構(gòu)見圖2)是泰拉菌素的關(guān)鍵合成前體，通過對去甲基阿奇霉素的4”-OH進行氧化并經(jīng)過一系列修飾，合成泰拉菌素。

4”-OH是去甲基阿奇霉素支鏈糖上具備反應(yīng)活性的三個仲羥基之一，有文獻報道采用Cbz卞酯保護[1]或者乙酰基[3]對另外兩個活性仲羥基12-OH、2’-OH進行保護，但上述方法中卞酯基與乙酰基均為無選擇性的單羥基保護，制得的產(chǎn)物需進行層析分離，收率較低。

圖1 泰拉菌素化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

圖2 去甲基阿奇霉素A化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

本研究設(shè)計了一套利用活性羥基鄰位基團對12-OH、2’-OH進行選擇性保護的方法，得到的雙保護去甲基阿奇霉素經(jīng)過corey-kim氧化[4]后脫保護，可以制得較純凈的4”-羰基去甲基阿奇霉素。

1 材料與設(shè)備

1.1 主要試劑 91%去甲基阿奇霉素A,20150201，寧夏泰瑞；丙酮，20141202，天津凱通，分析純；對甲苯磺酸，20150109，上海國藥，分析純；正辛烷，20141108，天津凱通，分析純；鄰苯二甲酸酐，20150115，上海國藥，分析純；46%氫溴酸，20140801，上海國藥，分析純；乙醇/乙醇鈉溶液，20150104，上海紫一；氫氧化鋰，20140903，上海國藥，分析純；水合肼，20150102，湖南株洲化工，96%；二氯乙烷，20150114，天津凱通，分析純；N-氯代琥珀酰亞胺，20141205，上海國藥。分析純；二氯亞砜，20150107，上海國藥，分析純。

1.2 主要試驗設(shè)備儀器 集熱式恒溫磁力攪拌器，DF101-S，天津華鑫儀器有限公司；多功能槳式

攪拌器，HJ-5，江蘇新壇金城國盛試驗儀器廠；電子稱，TE-621-L，賽多利斯科學(xué)儀器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，Hei-VAP /g6，德國海道夫；暗箱式自動紫外分析儀，ZF-2C，上海安亭儀器廠；旋片式真空泵，T215，美國圣特斯；精密增力電動攪拌器JJ1.100W，浦東光學(xué)物理儀器有限公司；紫外可見分光光度儀，I8，濟南海能儀器；LC高效液相色譜儀LC-20A，日本島津株式會社；高分辨飛行時間質(zhì)譜，micrOTOF III，Bruker；核磁共振波譜儀，AVANCE III HD，Bruker。

2 方法與結(jié)果

2.1 實驗方法 本研究采用兩步保護法，先利用12-OH與13-OH相鄰的特性，使用丙叉法[5]進行選擇性保護，再利用2’-OH與3’位的叔氨基相鄰，使用鄰苯二甲酸酐進行組合保護[6]，形成大環(huán)酰胺內(nèi)酯，達到對12-OH與2’-OH兩個活性羥基的保護。在4”-OH成功氧化后，通過溫和方法脫去保護基。

2.1.1 12-OH的保護 取7.63 g(0.01 mol)去甲基阿奇霉素，溶于50 mL丙酮(以溶劑形式過量存在)中，在氮氣保護下升溫至40 ℃，加入6.18 g(0.036 mol)對甲苯磺酸，回流攪拌4 h，去除氮氣保護，升溫至45 ℃開始減壓蒸餾，蒸餾至溶液粘稠時補加30 mL水，繼續(xù)減壓蒸餾。待無餾分蒸出時，降溫至常溫，使用4%的氫氧化鉀溶液將反應(yīng)體系pH調(diào)整至7.5～8.5，加入30 mL二氯乙烷萃取30 min，分去水相，將有機相蒸干，得到12,13-丙叉保護去甲基阿奇霉素，反應(yīng)過程如圖3所示。平均摩爾收率為96.4%。

圖3 12,13-丙叉保護去甲基阿奇霉素的合成

2.1.2 2’-OH的保護 將蒸干的12,13-丙叉保護去甲基阿奇霉素溶于40 mL正辛烷中，常溫攪拌，確保體系絕對無水，通入干燥氮氣保護。然后加入1.77(0.012 mol)對苯二甲酸酐，反應(yīng)180 min。此時4”-OH也被鄰苯二甲酸酐保護，但形成的保護單酯在堿性環(huán)境下并不穩(wěn)定。

將體系升溫至60 ℃，10 min之內(nèi)緩慢滴加1 mL 乙醇/乙醇鈉，破壞4”-OH形成的單酯[7]，滴加完成后反應(yīng)3 h。

降溫至室溫并撤去氮氣保護，加入30 mL水，萃取10 min后分去水相，將有機相蒸干，得到雙保護去甲基阿奇霉素，反應(yīng)過程如圖4所示。平均摩爾收率為91.2%，兩步保護總摩爾收率87.9%。

圖4 雙保護去甲基阿奇霉素的合成

2.1.3 Corey-kim氧化[4]將蒸干的雙保護去甲基阿奇霉素溶于30 mL二氯乙烷，降溫至-30 ℃，加入2.27 g氯代琥珀酰亞胺(0.017 mol)，保溫反應(yīng)1 h，緩慢滴加2.40 g氯化亞砜，滴加完畢后升溫至-25 ℃，保溫反應(yīng)6 h，加入30 mL水，升溫至常溫，加入20%氫溴酸調(diào)整pH至3.0～4.0，萃取，分去有機相。

將水相使用20%氫氧化鉀調(diào)整pH至8.0～9.0，加入30 mL二氯甲烷，分去水相，將有機相蒸干,得到4”-羰基雙保護去甲基阿奇霉素，反應(yīng)過程如圖5所示。氧化反應(yīng)平均摩爾收率86.2%。2.1.4 脫保護 將合成得到的4”-羰基雙保護去甲基阿奇霉素溶于30 mL二氯甲烷，升溫至40 ℃，緩慢滴加1.60 g(0.01 mol)20%水合肼[8]，保溫反應(yīng)8 h，得到4”-羰基去甲基阿奇霉素，反應(yīng)過程如圖6所示。脫保護反應(yīng)平均摩爾收率97.0%。

圖5 4”-羰基雙保護去甲基阿奇霉素的合成

圖6 4”-羰基去甲基阿奇霉素的合成

2.2 結(jié)果

2.2.1 鑒別 為確認實驗結(jié)果，關(guān)鍵產(chǎn)物物雙保護去甲基阿奇霉素(圖4)需要進行結(jié)構(gòu)確認。本研究使用Bruker的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測設(shè)備，確認產(chǎn)物分子量符合目標物符合目標物質(zhì)C51H83N2O14的原子量占比與摩爾質(zhì)量(表1)。

表1 液質(zhì)聯(lián)用分子量分布數(shù)據(jù)

之后將產(chǎn)物進行核磁C13-NMR檢測，確認碳鏈結(jié)構(gòu)與目標物相符。根據(jù)上述結(jié)果，實驗所得產(chǎn)物確為雙保護去甲基阿奇霉素，以下為C13-NMR結(jié)果：

13C NMR (100 MHz, CH2CL2) δ 177.11 (s), 170.54 (s), 136.19 (s), 133.78 (s), 129.46 (d, J = 9.4 Hz), 128.49 (s), 127.59 (s), 111.47 (s), 97.28 (d, J = 52.1 Hz), 85.64 (s), 81.44 (s), 79.15 (s), 76.76 (s), 75.55 (t, J = 11.3 Hz), 70.45 (d, J = 8.2 Hz), 67.99 (s), 67.00 (s), 56.07 (s), 54.12 (s), 52.61 (s), 49.46 (s), 47.39 (d, J = 56.3 Hz), 43.80 (s), 37.96 (d, J = 43.7 Hz), 36.57 (s), 32.16 (s), 28.40 (s), 27.15 (s), 26.27 (s), 24.19 (s), 22.39 (s), 19.27 (s), 18.74 - 17.47 (m), 17.05 (s), 14.70 (s), 13.79 (s), 10.74 (s), 6.31 (s).

2.2.2 色譜結(jié)果與收率 為確認產(chǎn)物收率，我們將兩種保護產(chǎn)物即12,13-丙叉保護去甲基阿奇霉素與雙保護去甲基阿奇霉素進行HPLC法進行含量確認(圖7、圖8)，檢測采用210 nm波長，乙腈∶甲醇∶30%磷酸氫二鉀=33∶35∶32的比例配置流動相，結(jié)果經(jīng)歸一法處理[9]，得到以下結(jié)果。

圖7 12,13-丙叉保護去甲基阿奇霉素液相色譜圖

圖8 雙保護去甲基阿奇霉素液相色譜圖

從圖7、圖8可以看出，采用同樣波長與檢測方法，12,13-丙叉保護去甲基阿奇霉素與雙保護去甲基阿奇霉素的出峰時間相差近8 min，是由于游離羥基大幅度減少造成的產(chǎn)物極性下降，也側(cè)面驗證的保護是成功的。而在圖8中，12.152 min處12,13-丙叉保護去甲基阿奇霉素幾乎已經(jīng)完全反應(yīng)。

將液相色譜得到的含量(峰面積)與產(chǎn)物質(zhì)量進行計算，從去甲基阿奇霉素開始到合成雙保護去甲基阿奇霉素，產(chǎn)物平均含量為91.1%，平均摩爾收率為87.9%。

2.2.3 后續(xù)合成結(jié)果 將Corey-kim氧化后得到的4”-羰基去甲基阿奇霉素繼續(xù)向下合成[1,3]，經(jīng)過環(huán)氧化、氨化兩步反應(yīng)后，得到產(chǎn)物泰拉霉素，經(jīng)與對照品進行比對檢驗，產(chǎn)品含量達到92.4%，總摩爾收率71.5%。

3 討論與小結(jié)

去甲基阿奇霉素共有5個羥基，其中6-OH、13-OH為叔羥基，反應(yīng)活性較差，而12-OH、2’-OH、4”-OH均為仲羥基，反應(yīng)活性接近。尤其是2’-OH、4”-OH均為側(cè)鏈糖上的羥基，活性較強。

在其他文獻報道的泰拉霉素合成方法中[1-3]，研究重點通常是紅霉素A肟的貝克曼重排反應(yīng)，而對去甲基阿奇霉素及其保護描述較為簡略，僅描述了使用乙?；?、Cbz卞酯基對活性羥基進行保護的實驗過程，而未詳細討論羥基的選擇性保護問題。在實際研究中，筆者發(fā)現(xiàn)采用上述保護方法對去甲基阿奇霉素進行保護，會得到多種副產(chǎn)物，即使調(diào)整反應(yīng)條件也無法使反應(yīng)針對性的保護12-OH與2’-OH，仍需經(jīng)過層析分離才能得到得目標產(chǎn)物。因此，本研究重點關(guān)注了去甲基阿奇霉素羥基的選擇性保護問題，在進行羥基保護過程中，避免了因競爭反應(yīng)造成的副反應(yīng)程度高、目標產(chǎn)物得率低的問題。

本研究利用了羥基鄰位的活性集團對目標羥基進行了選擇性保護，對12-OH采用鄰羥基丙叉保護，對2’-OH利用了鄰叔氨基進行了鄰苯二甲酸酐成大環(huán)酰胺內(nèi)酯的保護。其中12-OH的間位10-N其實也存在一個仲氨基，其結(jié)構(gòu)、位置均與2’-OH與鄰位二甲胺基的位置相似。在采用丙叉保護前，也考慮過采用鄰苯二甲酸酐一次性合成兩個大環(huán)酰胺內(nèi)酯，進行一次性保護。但由于10-N是仲氨基，與鄰苯二甲酸酐反應(yīng)時，易與仲氨基接形成含有亞胺結(jié)構(gòu)的內(nèi)酯雜環(huán)[10]，難以與間位羥基進行反應(yīng)，而且改變了大環(huán)內(nèi)脂的相關(guān)結(jié)構(gòu)。

基于上述原因，本研究利用12,13位鄰羥基，進行丙叉保護，形成的叉酮具有較強的位阻效應(yīng)，同時阻止了第二步保護時鄰苯二甲酸酐對10-N的酰胺化，達到了同時保護羥基與氨基的目的。

丙叉保護在有水存在的條件下，堿性回流可以脫除，而大環(huán)酰胺內(nèi)酯則需要肼的特殊作用可以進行水解。因此，采用20%的水合肼進行回流反應(yīng)，可以一步脫除兩種保護集團，得到完整的4”-羰基去甲基阿奇霉素。因此，本研究采用的雙丙叉基、大環(huán)酰胺內(nèi)酯雙保護能夠有效對去甲基阿奇霉素的活性羥基進行選擇性保護，同時脫保護反應(yīng)溫和，不會對分子結(jié)構(gòu)與反應(yīng)造成影響。

致謝：對蘇州大學(xué)陸新華博士為本研究提供重要合成理論支持表示感謝。

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(編輯：李文平)

Research of Selective Protection for Hydroxyl of Azithromycin Demethylate

ZHAO Bo-Long，ZHANG Ping*

(NingxiaTairuiPharmactlalCo.,Ltd,Yinchuan750101,China)

In order to resolve the problem that the reaction selectivity of azithromycin demethylate’s hydroxyl, acetone and phthalic anhydride were used to double protection the adjacent hydroxyl of azithromycin demethylate, and leave only the 4”-OH had reactivity. The reaction yield was 87.9% and the product could be directly used for the synthesis of tulathromycin. This research achieved azithromycin demethylate’s selective protection of hydroxyl.

azithromycin demethylate; acetone; o-phthalic anhydride; tulathromycin

趙伯龍，碩士，化學(xué)工程師，從事抗生素提取與合成研究。

張萍。E-mail:shiyanpeng@tairuiworld.com

2015-08-22

A

1002-1280 (2015) 10-0046-06

S859.79