慢性阻塞性肺疾病大鼠肺表面活性蛋白A表達(dá)的變化

索丹

慢性阻塞性肺疾病大鼠肺表面活性蛋白A表達(dá)的變化

索丹

目的以煙熏慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠的肺組織為標(biāo)本, 檢測(cè)肺表面活性蛋白A(SPS-A)在COPD病程中的變化。方法選取健康雄性七周齡Wistar大鼠25只, 體重180～220 g, 隨機(jī)分為對(duì)照組(5只)與COPD組(20只)。采用煙熏法制備COPD大鼠模型, 按照COPD病程的時(shí)間分為4組, 每組5只, 分別為COPD 1 d組(A組)、COPD 1月組(B組)、COPD 2月組(C組)、COPD 3月組(D組)。采用免疫組織化學(xué)法, 檢測(cè)表面活性蛋白A在各組大鼠肺組織中的表達(dá)。結(jié)果該法建立COPD大鼠模型的肺組織病理學(xué)改變基本符合人類COPD組織病理學(xué)改變特點(diǎn)。免疫組化顯示COPD組的A、B、C、D組 SP-A檢測(cè)結(jié)果(OD值), 與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01), COPD組中D組SP-A檢測(cè)結(jié)果(OD值)較A、B、C組有所回升, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論SP-A在煙熏COPD大鼠肺組織中的表達(dá)比正常對(duì)照組明顯減少, 與肺氣腫的嚴(yán)重程度成負(fù)相關(guān)。COPD大鼠肺組織中SP-A明顯減少可能是COPD發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。

慢性阻塞性肺疾病；肺表面活性蛋白A；煙熏

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是世界上發(fā)病率和死亡率的重要原因之一。肺表面活性物質(zhì)(PS)是一種脂質(zhì)與特異蛋白結(jié)合而成的脂蛋白復(fù)合物 , 主要由肺泡II型上皮細(xì)胞合成,能降低肺泡的液-氣界面表面張力 , 以防止肺泡在低肺容量時(shí)塌陷 , 對(duì)維持肺的正常功能至關(guān)重要。SP-A主要在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中表達(dá)[1], 是肺表面活性物質(zhì)的重要成分之一, 本實(shí)驗(yàn)觀察了煙熏所致肺氣腫模型肺組織中SP-A表達(dá)變化 , 并與肺組織病理學(xué)改變進(jìn)行對(duì)比研究 , 以探討其在COPD中的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性7周齡Wistar大鼠25只, 體重180～220 g(由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗SP-A購(gòu)自武漢博士德公司, 免疫組化SABC試劑盒和DAB顯色試劑盒均為武漢博士德公司產(chǎn)品, Poly-Lysine防脫片劑購(gòu)自武漢博士德公司

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備 冰箱；圖像分析軟件： NIS-Elements BR2.0型 日本尼康公司；顯微鏡：ECLIPSE E800型日本尼康公司；冰凍切片機(jī) LEICA CM 1900 德國(guó)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 采用煙熏法制備COPD大鼠模型。根據(jù)文獻(xiàn)介紹[2]：煙熏70 d大鼠可以形成COPD模型, 因此以煙熏70 d為準(zhǔn),進(jìn)行取材。25只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(5只)與COPD組(20只), 按照COPD病程的時(shí)間分為4組, 每組5只, , 分別為COPD1 d組(A組)；COPD1月組(B組)；COPD2月組(C組)；COPD 3月組(D組)。分別在形成COPD后1 d、1、2、3個(gè)月取材。

1.2.2 標(biāo)本制備 氯胺酮(100 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠。顯露氣管, 開(kāi)胸。取右肺全肺, 于10%甲醛固定, 常規(guī)脫水、石蠟包埋, 4 um厚度連續(xù)切片3張, 用于免疫組化檢測(cè)。

1.2.3 免疫組化法測(cè)定SP-A的表達(dá) 免疫組化染色法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行, 載玻片選擇Poly-Lysine防脫片劑處理。SP-A以胞漿棕黃色為陽(yáng)性。采用NIS-Elements BR2.0型圖象分析儀測(cè)定SP-A陽(yáng)性細(xì)胞的光密度( OD值)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

對(duì)照組與COPD組肺泡Ⅱ 型上皮細(xì)胞 , 細(xì)支氣管上皮均可見(jiàn)SP-A表達(dá)。對(duì)照組未檢到陽(yáng)性表達(dá)；COPD組中 A、B、C組OD值較對(duì)照組明顯減少(P＜0.01)；D組OD值增加, 分別由(0.1505±0.0005)降至(0.1385±0.0108)、(0.1311±0.0011)、(0.1257±0.0490)、(0.1431±0.0005)。COPD組OD值明顯低于對(duì)照組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 大鼠肺臟SPA檢測(cè)結(jié)果(±s)

表1 大鼠肺臟SPA檢測(cè)結(jié)果(±s)

注：與對(duì)照組比較,aP＜0.01； 與A、B、C組比較,bP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)(只) OD 值對(duì)照組 5 0.1505±0.0005 COPD組A組 5 0.1385±0.0108aB組 5 0.1311±0.0011aC組 5 0.1257±0.0490aD組 5 0.1431±0.0005ab

3 討論

COPD是一種具有氣流受限特征的可以預(yù)防和治療的疾病, 氣流受限不完全可逆, 呈進(jìn)行性發(fā)展, 與肺部對(duì)香煙、煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)。PS是由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物, 其中90%是磷脂, 以二棕櫚酰卵磷脂和磷脂酰甘油為主, 后兩者是降低肺泡表面張力的主要活性成分。8%～10%是與脂質(zhì)特異性結(jié)合的蛋白質(zhì), 稱之為肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白(SPs)。SPs是70 年代末才被認(rèn)識(shí)的一類蛋白質(zhì), 目前已發(fā)現(xiàn)的SPs 包括親水性的SP-A、SP-D 和疏水性的SP-B、SP-C。其中, SP-A 和SP-D 都是糖結(jié)合蛋白, 屬于膠凝素家族成員, 主要由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和Clara 細(xì)胞合成和分泌。SP-A 和SP-D是先天免疫系統(tǒng)的成員[3]。SP-A 是最先被發(fā)現(xiàn)且在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中表達(dá)最強(qiáng)烈、信號(hào)最豐富的蛋白。SP-A可以幫助形成具有高度表面活性的管狀髓鞘結(jié)構(gòu), 調(diào)節(jié)表面活性物質(zhì)磷脂的循環(huán)和分泌, 協(xié)助表面活性物質(zhì)磷脂降低肺泡表面張力, 增強(qiáng)肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬和殺傷能力。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SP-A在煙熏COPD大鼠肺組織中的表達(dá)比正常對(duì)照組明顯減少, 且COPD形成后1 d～2個(gè)月SP-A的表達(dá)逐漸減少。肺氣腫3個(gè)月后SP-A的表達(dá)有所增加, 提示隨著肺泡重建, Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的合成增多, 其功能亦有恢復(fù), 合成SP-A增多。

綜上所述, SP-A的減少可以促進(jìn)COPD的發(fā)生發(fā)展。對(duì)于SP-A的檢測(cè)提示COPD大鼠肺組織中SP-A明顯減少可能是肺氣腫發(fā)展的重要因素之一。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于臨床,作為COPD的診斷及病情觀察, 以及外源性SP-A應(yīng)用于臨床治療COPD有待進(jìn)一步研究。

[1]葉燕青, 李清泉, 程真順, 等. 不同因素致急性肺損傷大鼠的病理轉(zhuǎn)歸及肺泡表面活性蛋白-A的動(dòng)態(tài)變化. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 2009, 32(12):950-952.

[2]Spragg RG, Smith RM. Pathology of the surfactant system of the mature lung. Am J Respir Crit Care Med, 1997, 155(2):756-760.

[3]常紹鴻. 支氣管哮喘患者血清SP-A和IL-5測(cè)定及其相關(guān)性研究. 醫(yī)學(xué)信息, 2012, 25(6):163.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.18.213

2015-04-13]

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