酮咯酸氨丁三醇眼用凝膠劑對(duì)兔金黃色葡萄球菌性角膜潰瘍的保護(hù)作用

胡 芳，徐婷君（1.嘉興市第二醫(yī)院眼科，浙江嘉興 314000；.平湖市第一人民醫(yī)院眼科，浙江 平湖 31400）

角膜潰瘍是一種臨床上常見(jiàn)的發(fā)病于眼球前層薄膜處的潰瘍性病變，其發(fā)病原因較多且極其復(fù)雜，除嚴(yán)重的外傷或者感染外，也可并發(fā)于結(jié)核或面癱等[1]。臨床上最為常見(jiàn)的類(lèi)型主要為金黃色葡萄球菌性角膜潰瘍，顧名思義，其發(fā)病原因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌感染，隨后機(jī)體產(chǎn)生角膜浸潤(rùn)和抗體反應(yīng)；患者最為典型的癥狀為怕光、眼睛疼痛、結(jié)膜充血紅腫[2-3]。如果沒(méi)有得到及時(shí)科學(xué)的治療，嚴(yán)重者隨著潰瘍程度的加重，可嚴(yán)重?fù)p傷其眼角膜。因此，科學(xué)有效地針對(duì)金黃色葡萄球菌所致的角膜潰瘍進(jìn)行治療顯得尤為重要[4]。酮咯酸氨丁三醇（Ketorolac tromethamine）屬非甾體類(lèi)抗炎藥，可溶于水，有較好的局部滲透作用；配成水溶性滴眼液可抑制眼內(nèi)組織前列腺素（PGs）的生物合成，明顯降低房水中的PGs 水平以及由PGs 引起的血-房水屏障破壞等炎癥反應(yīng)，有效控制炎癥。其主要用于解除由過(guò)敏性結(jié)膜炎所致的眼部瘙癢、不適，具有消炎止痛作用[5]。本文針對(duì)金黃色葡萄球菌性角膜潰瘍，研究酮咯酸氨丁三醇眼用凝膠劑對(duì)兔金黃色葡萄球菌性角膜潰瘍的保護(hù)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

BL-5000型裂隙燈顯微鏡（上海博覽光電儀器有限公司）；保溫箱（北京福意電器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

酮咯酸氨丁三醇眼用凝膠（沈陽(yáng)興齊眼科股份有限公司，批號(hào)：20120510、20120511、20130512，規(guī)格：5 ml ∶600 mg、5 ml ∶400 mg、5 ml ∶200 mg）；鹽酸氯胺酮注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：H32022820，規(guī)格：2 ml ∶0.1 g）；鹽酸異丙嗪注射液（上海禾豐制藥有限公司，批號(hào)：H31022033，規(guī)格：2 ml ∶50 mg）；克拉霉素眼用凝膠（浙江亞太藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：H20058223，規(guī)格：5 ml ∶200 mg）；生理鹽水（天津藥業(yè)焦作有限公司，批號(hào)：H20044024，規(guī)格：10 ml∶90 mg）。

1.3 動(dòng)物

1.4 菌株

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 25923）購(gòu)自上海士鋒生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)

在金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株上挑取單個(gè)菌落，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第1天將其接種于含胎牛血清的培養(yǎng)基上，隨后在保溫箱里進(jìn)行培養(yǎng)，最后向所培養(yǎng)的菌株里加入生理鹽水，制備成菌懸液[6]。整個(gè)過(guò)程要注意無(wú)菌操作，保證菌種的單一性，同時(shí)控制菌懸液的細(xì)胞密度為3.0×109ml－1左右。

2.2 復(fù)制角膜潰瘍模型

采用角膜實(shí)質(zhì)層接種法。分別將1 ml鹽酸氯胺酮注射液和1 ml鹽酸異丙嗪注射液混合后，sc給藥；待家兔達(dá)到全麻的效果后，將事先準(zhǔn)備好的0.1 ml金黃色葡萄球菌懸液從角膜中央緩慢注入實(shí)質(zhì)層，待角膜形成5.0 mm的混濁區(qū)時(shí)停止注射，即模型復(fù)制完畢。

2.3 分組與給藥

取100只家兔，分籠進(jìn)行喂養(yǎng)，嚴(yán)格遵循喂養(yǎng)原則，按時(shí)給予充足的食物和水。本次實(shí)驗(yàn)之前，所有家兔經(jīng)裂隙燈顯微鏡觀察眼部情況，均顯示正常。實(shí)驗(yàn)時(shí)，采用角膜實(shí)質(zhì)層接種法復(fù)制金黃色葡萄球菌性角膜潰瘍家兔模型，并按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分成模型（生理鹽水）組、陽(yáng)性對(duì)照（克拉霉素眼用凝膠）組和凝膠劑高、中、低劑量（酮咯酸氨丁三醇眼用凝膠劑120、80、40 mg/ml）組，每組20只，保證各組的潰瘍面積大小無(wú)差異。每組家兔每日給藥1次，每次1滴，連續(xù)給藥2周。每次劑量嚴(yán)格按照研究要求進(jìn)行，用藥部位為角膜潰瘍面。

2.4 觀察指標(biāo)和療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2.4.1 角膜評(píng)分 按照改進(jìn)的McNeill 角膜病變程度分級(jí)法進(jìn)行角膜評(píng)分[7]：0 分為角膜實(shí)質(zhì)層清晰；1 分為角膜輕度水腫；2 分為角膜嚴(yán)重水腫；3 分為角膜明顯混濁；4 分為角膜嚴(yán)重水腫且前房積膿。

2.4.2 臨床療效評(píng)價(jià) 依據(jù)原衛(wèi)生部頒布的《藥物臨床研究指導(dǎo)原則》，分為顯效、有效、無(wú)效3級(jí)。其中，顯效為潰瘍面積小于1 mm；有效為潰瘍面積2～5 mm；無(wú)效為潰瘍面積大于5 mm?？傆行剩剑拷M顯效例數(shù)+有效例數(shù)）/每組總數(shù)×100%。

2.5 視網(wǎng)膜觀察

于末次給藥后，顯微鏡觀察各組家兔的視網(wǎng)膜變化。具體病理切片制作步驟：將固定好的眼球取出，以摘除眼球時(shí)標(biāo)記的打藥位置為中心矢狀切除兩旁組織，保留脈絡(luò)膜上腔注射位置兩邊各0.5 cm 寬的由角膜頂端至視神經(jīng)孔的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。將切好的組織標(biāo)本置于體積分?jǐn)?shù)為70%、80%、85%、95%的乙醇中，分別脫水50 min，再以無(wú)水乙醇脫水3 次，各1 h。用二甲苯浸泡眼球30 min，使組織透明。將加熱溶解的石蠟（石蠟熔點(diǎn)為60 ℃左右）浸入組織各1 h，然后立即埋于石蠟中進(jìn)行冷卻。制好的蠟塊放置于切片機(jī)上切片，切片貼附在載玻片上進(jìn)行70 ℃烘烤1 h。將載玻片浸入二甲苯10 min、無(wú)水乙醇1 min 及95%、90%、85%乙醇各1 min 進(jìn)行脫蠟，然后蒸餾水沖洗。將沖洗好的載玻片進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，染色后使用80%、95%、95%乙醇和無(wú)水乙醇分別清洗1 min，二甲苯清洗約2 min，中性樹(shù)脂膠封固，于顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜變化。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 治療前后角膜評(píng)分比較

與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和凝膠劑各劑量組家兔給藥后角膜潰瘍病變均有改善，角膜評(píng)分減小、總有效率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且凝膠劑高、中劑量組效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05）。各組家兔給藥前后角膜評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1，療效評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2。

3.2 組織結(jié)構(gòu)

各組家兔均未發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)血管異常擴(kuò)張、視網(wǎng)膜下出血以及炎癥滲出等反應(yīng)。這表明本實(shí)驗(yàn)對(duì)視網(wǎng)膜無(wú)影響。各組家兔給藥后視網(wǎng)膜切片圖見(jiàn)圖1。

表1 各組家兔給藥前后角膜評(píng)分結(jié)果Tab 1 Keratopathy score of rabbits in each group before and after medication

表2 各組家兔給藥前后療效評(píng)價(jià)結(jié)果[例（%）]Tab 2 Therapeutic efficacy of rabbits in each group before and after medication[case（%）]

圖1 各組家兔給藥后視網(wǎng)膜切片圖（HE，×100）A.模型組；B.陽(yáng)性對(duì)照組；C.凝膠劑高劑量組；D.凝膠劑中劑量組；E.凝膠劑低劑量組Fig 1 Retinal slice of rabbits in each group after medication（HE，×100）A.model group；B.positive control group；C.gel high-dose group；D.gel medium-dose group；E.gel low-dose group

4 討論

角膜潰瘍是臨床上常見(jiàn)的眼部疾病，多數(shù)情況下是由細(xì)菌引起的，特別是金黃色葡萄球菌，這主要由于金黃色葡萄球菌分布較廣和致病性較強(qiáng)，常常引發(fā)各種感染[8]。目前臨床上針對(duì)金黃色葡萄球菌所致的角膜潰瘍多采用抗生素類(lèi)藥物進(jìn)行治療，然而隨著藥物的長(zhǎng)期應(yīng)用，已出現(xiàn)明顯的耐藥性，因此臨床上有必要找到新的抗生素類(lèi)藥物來(lái)對(duì)抗此類(lèi)疾病。同時(shí)由于角膜潰瘍危害性之大、發(fā)病率之高，找到科學(xué)有效的治療藥物迫在眉睫[9]。本次實(shí)驗(yàn)中針對(duì)家兔金黃色葡萄球菌性角膜潰瘍采用兩種方法進(jìn)行治療，其中陽(yáng)性對(duì)照組采用克拉霉素眼用凝膠進(jìn)行治療?？死顾厥且环N在紅霉素的基礎(chǔ)上研制而成的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，其抗菌范圍較廣，能夠應(yīng)對(duì)各種適應(yīng)證，且抗菌效果較好，已經(jīng)在臨床上得到廣泛的應(yīng)用[10]；然而，由于其水溶性較差，藥物吸收量較小，臨床治療效果并不明顯，應(yīng)用于眼科治療時(shí)具有一定局限性。另一種方法是采用酮咯酸氨丁三醇眼用凝膠劑進(jìn)行治療，其能夠在較短的時(shí)間內(nèi)緩解和消除疼痛，通過(guò)抑制PGS的合成來(lái)發(fā)揮作用，在短期即可抵抗金黃色葡萄球菌所致的感染，并對(duì)潰瘍面進(jìn)行修復(fù)，促進(jìn)潰瘍的愈合，具有較好的臨床效果[11]。在本次實(shí)驗(yàn)中，對(duì)5 組家兔治療前后角膜評(píng)分和療效進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)凝膠劑各劑量組家兔治療后角膜評(píng)分明顯低于治療前，且明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組，總有效率明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

綜上所述，酮咯酸氨丁三醇眼用凝膠劑對(duì)兔金黃色葡萄球菌性角膜潰瘍有較為明顯的保護(hù)作用，既可有效減輕角膜病變，又可縮小角膜潰瘍面積，顯著提高治療有效率，為該藥臨床使用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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