劉 里,成飛翔(曲靖師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,云南曲靖 655011)
血清白蛋白是一類重要的運(yùn)輸性蛋白,在生物體內(nèi)的循環(huán)系統(tǒng)中含量非常豐富,幾乎占血清蛋白的60%。近年來(lái)采用光譜研究藥物與血清白蛋白的相互作用已成為生命科學(xué)、化學(xué)、藥學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),這對(duì)于了解生命過(guò)程、藥物作用機(jī)制及藥物分子設(shè)計(jì)等都具有重要作用[1-4]。因結(jié)構(gòu)上和人血清白蛋白的相似性,牛血清白蛋白(BSA)被廣泛運(yùn)用于與藥物結(jié)合作用的研究。頭孢丙烯(Cefprozil,CE)屬第二代高效、低毒、耐酶頭孢菌素類抗生素,常用于治療敏感菌所致的輕、中度感染,包括上、下呼吸道感染,以及皮膚和皮膚軟組織感染等[5]。因此,研究CE 與BSA 的相互作用對(duì)理解藥物的作用機(jī)制具有重要意義。以往研究藥物與BSA相互作用主要集中在猝滅機(jī)制探討上,而本文在優(yōu)化試驗(yàn)條件的情況下研究了CE與BSA的結(jié)合反應(yīng),除了常規(guī)的作用機(jī)制研究外,還深入探討了不同溫度下兩者的結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合力類型、結(jié)合部位、藥物之間的協(xié)同性以及藥物對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響等,現(xiàn)報(bào)道如下。
pHS-3C 型精密酸度計(jì)(上海虹益儀器儀表有限公司);Cary50型紫外-可見(jiàn)分光光譜儀(美國(guó)瓦里安技術(shù)中國(guó)有限公司);F-4600 型熒光光譜儀(日本日立公司,測(cè)定參數(shù):狹縫寬度5 nm,光電倍增管負(fù)高壓400 V)。
CE(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):130567-201203,純度:94.9%);牛血清白蛋白(上??笊锛夹g(shù)有限公司,純度:98%);其余試劑均為分析純,水為超純水。
取10.0 ml比色管,加入BSA(1.0×10-5mol/L)2.0 ml,再分別加入9.490×10-5mol/L的CE溶液0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.25、2.5、3 ml,然后加入三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)溶 液(0.2 mol/L、pH 7.4)2.0 ml、NaCl 溶液(0.5 mol/L)2.0 ml(以維持正常生理離子強(qiáng)度),最后用水稀釋至刻度并搖勻,分別在289、299、309 K 溫度下作用50 min。此時(shí)體系中BSA 的濃度為2.0×10-6mol/L,CE 的濃度分別為0、0.237 3×10-6、0.474 5×10-6、0.711 8×10-6、0.949 0×10-6、1.186 3×10-6、1.423 5×10-6、1.660 8×10-6、1.898 0×10-6、2.135 3×10-6、2.372 5×10-6、2.847 0×10-6mol/L(編號(hào)依次為1~12)。作用完畢后立即以最大激發(fā)波長(zhǎng)(λex)280 nm、最大發(fā)射波長(zhǎng)(λem)342 nm在熒光光譜儀上記錄熒光猝滅光譜,并分別以Δλ=15、60 nm 繪制289 K溫度下CE-BSA體系的同步熒光光譜,記錄F0和F(F和F0分別指CE存在與不存在時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度)。
289 K溫度下CE-BSA體系的熒光猝滅光譜見(jiàn)圖1。
圖1 289 K溫度下CE-BSA體系的熒光猝滅光譜圖Fig 1 Fluorescence quenching spectrogram of CE-BSA system at 289 K
由圖1 可見(jiàn),CE 在測(cè)量波段沒(méi)有熒光,而B(niǎo)SA 的熒光較強(qiáng)。在λex/λem=280/342 nm 處,當(dāng)CE 加入到BSA 之后,雖然λex/λem幾乎未發(fā)生變化,但是其熒光強(qiáng)度明顯隨著CE濃度的增加而逐漸減弱,表明CE 能猝滅BSA 的熒光,兩者之間存在相互作用。
引起熒光猝滅的原因很多,但通常分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。常用溫度的改變而引起體系的變化來(lái)確定猝滅類型:在動(dòng)態(tài)猝滅中分子擴(kuò)散起主導(dǎo),猝滅常數(shù)會(huì)隨著溫度的升高而增大;對(duì)于靜態(tài)猝滅,因有新物質(zhì)生成,穩(wěn)定性起主導(dǎo)作用,溫度越高,猝滅常數(shù)反而越小[6]。
2.3.1 Stern-Volmer 方程 動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程應(yīng)遵循Stern-Volmer方程:F0/F=1+KSV[c]=1+Kqτ0[c],式中,KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù),Kq為動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)[動(dòng)態(tài)猝滅時(shí)最大值約為2×1010L/(mol·s)][6],τ0為熒光體平均壽命(一般為10-8s 數(shù)量級(jí))[6],[c]為CE 濃度。以289、299、309 K 時(shí)的F0/F對(duì)[c]作圖,根據(jù)Kq=KSV/τ0可求出不同溫度下的Kq。不同溫度下CE 對(duì)BSA 熒光猝滅的Stern-Volmer曲線見(jiàn)圖2,Stern-Volmer方程及相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表1。
圖2 不同溫度下CE-BSA體系的Stern-Volmer曲線Fig 2 Stern-Volmer curves of CE-BSA system at different temperatures
表1 不同溫度下CE-BSA 體系的Stern-Volmer 方程及相關(guān)參數(shù)Tab 1 Stern-Volmer equations and correlative parameters of CE-BSA system at different temperatures
由表1可見(jiàn),3個(gè)溫度下的Kq比動(dòng)態(tài)猝滅最大速率常數(shù)[2×1010L/(mol·s)]大2個(gè)數(shù)量級(jí),說(shuō)明CE對(duì)BSA的猝滅不屬于動(dòng)態(tài)猝滅。由圖2 可知,3 個(gè)溫度下的Stern-Volmer 曲線均呈良好的線性關(guān)系,且隨著溫度的升高,直線斜率即KSV減小,正好與靜態(tài)猝滅機(jī)制一致。
2.3.2 Lineweaver-Burk方程 若CE對(duì)BSA為靜態(tài)猝滅,應(yīng)符合Lineweaver-Burk 方程[7-9]:(F0-F)-1=F0-1+(KLBF0[c])-1,式中,KLB為靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)。以(F0-F)-1對(duì)[c]-1作不同溫度下的Lineweaver-Burk 曲線。不同溫度下FCE 對(duì)BSA 熒光猝死的Lineweaver-Burk 曲線見(jiàn)圖3,Lineweaver-Burk 方程及相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表2。
圖3 不同溫度下CE-BSA體系的Lineweaver-Burk曲線Fig 3 Lineweaver-Burk curves of CE-BSA system at different temperatures
由圖3 可知,隨著溫度的升高,直線斜率逐漸增大,則KLB逐漸下降,這與因靜態(tài)猝滅方式而形成的復(fù)合物隨溫度升高越不穩(wěn)定的作用機(jī)制一致。由表2可知,3個(gè)溫度下的KLB都在104數(shù)量級(jí)以上,表明CE 與BSA 由于發(fā)生靜態(tài)猝滅而結(jié)合力較強(qiáng)。
表2 不同溫度下CE-BSA體系的Lineweaver-Burk方程及相關(guān)參數(shù)Tab 2 Lineweaver-Burk equations and correlative parameters of CE-BSA system at different temperatures
2.3.3 紫外吸收光譜[7-9]按“2.1”項(xiàng)下方法制備289 K下作用50 min 的CE-BSA 體系1~12,以相應(yīng)濃度的CE 為參比,在紫外-可見(jiàn)光譜儀上對(duì)體系進(jìn)行紫外光譜掃描,得到CE 與BSA結(jié)合后的紫外吸收光譜圖。紫外吸收光譜見(jiàn)圖4。
圖4 紫外吸收光譜圖Fig 4 UV absorption spectrum
由圖4 可見(jiàn),CE 的加入使BSA 中苯環(huán)上的π-π*躍遷引起的特征吸收峰從280 nm 移到274 nm,吸收強(qiáng)度也隨CE 濃度的增加而增加。CE 的加入引起B(yǎng)SA 紫外吸收光譜的變化這一現(xiàn)象,說(shuō)明CE與BSA間發(fā)生反應(yīng),有新物質(zhì)生成,更進(jìn)一步證明兩者之間的相互作用機(jī)制屬于靜態(tài)猝滅機(jī)制。
如CE與BSA存在n個(gè)等同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn),其相互作用的關(guān)系應(yīng)符合雙對(duì)數(shù)方程:lg[(F0-F)/F]=lgKb+nlg[c]。分別在289、299、309 K 溫度下,以lg[(F0-F)/F]對(duì)lg[c]作圖,以直線的斜率和截距求出CE 與BSA 不同溫度下的結(jié)合常數(shù)(Kb)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)。不同溫度下lg[(F0-F)/F]-lg[c]曲線見(jiàn)圖5,不同溫度下CE 對(duì)BSA 熒光猝滅的雙對(duì)數(shù)方程及相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表3。
圖5 不同溫度下CE-BSA體系的lg[(F0-F)/F]-lg[c]曲線Fig 5 lg[(F0-F)/F]-lg[c]curves of CE-BSA system at different temperatures
表3 不同溫度下CE-BSA體系的雙對(duì)數(shù)方程及相關(guān)參數(shù)Tab 3 Double logarithmic equations and correlative parameters of CE-BSA system at different temperatures
由表3 可見(jiàn),3 個(gè)溫度下的n都約等于1,表明CE 與BSA結(jié)合后可形成一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。隨著溫度增加,Kb和n值減少的程度不大,表明CE 與BSA 的相互作用對(duì)溫度變化不是很敏感。這說(shuō)明溫度的提升不利于血清白蛋白攜帶著CE 在體內(nèi)進(jìn)行運(yùn)轉(zhuǎn)、貯存和分配。
根據(jù)熱力學(xué)公式[10]計(jì)算289、299、309 K溫度下CE與BSA結(jié)合反應(yīng)的焓變(ΔH)、熵變(ΔS)及吉布斯自由能變(ΔG),結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 不同溫度下CE與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Tab 4 Thermodynamic parameters of the interaction between CE and BSA at different temperatures
由表4 可見(jiàn),ΔG<0,表明BSA 與CE 的反應(yīng)能自發(fā)進(jìn)行;ΔH<0,表明反應(yīng)為放熱反應(yīng);ΔH<0且ΔS<0,表明氫鍵和范德華力是CE與BSA的主要結(jié)合作用力。
應(yīng)用Maciazek-Jurczyk M、劉保生、梁宏等[11-13]提出的方法,比較激發(fā)波長(zhǎng)為280、295 nm 時(shí)CE-BSA 體系熒光程度的變化情況。CE-BSA體系的熒光猝滅曲線見(jiàn)圖6。
圖6 CE-BSA體系的熒光猝滅曲線Fig 6 Fluorescence quenching curves of CE-BSA system
由圖6 可知,280、295 nm 激發(fā)波長(zhǎng)下,CE 對(duì)BSA 的猝滅程度曲線沒(méi)有重疊,說(shuō)明色氨酸和酪氨酸殘基都參與其中。對(duì)比這兩種波長(zhǎng)下的熒光猝滅程度可知,在280 nm 激發(fā)時(shí)降低程度更大些,這說(shuō)明在CE 與BSA 的結(jié)合過(guò)程中,結(jié)合位點(diǎn)主要位于亞螺旋域ⅡA。
Maciazek-Jurczyk M、劉保生、梁宏等[11-13]認(rèn)為藥物協(xié)同性是指藥物與具有多重結(jié)合部位的BSA 結(jié)合過(guò)程中各結(jié)合部位之間可能存在相互影響作用,可用Hill 方程進(jìn)行分析:lg[H/(1-H)]=lgKH+nHlg[c],式中,H為結(jié)合飽和分?jǐn)?shù),KH為結(jié)合常數(shù),nH為Hill 系數(shù)。在熒光試驗(yàn)中:H/(1-H)=B/(Bm-B),其中,B為(F0-F)/F0;1/Bm為1/B對(duì)1/[c]作圖的截距。不同溫度下CE-BSA體系的nH值結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 不同溫度下CE-BSA體系的nH值Tab 5 The value of nHof CE-BSA system at different temperatures
由表5可知,3個(gè)溫度下的nH都略小于1,表現(xiàn)為弱的負(fù)協(xié)同作用,說(shuō)明CE與BSA結(jié)合過(guò)程中,隨著配體CE不斷地結(jié)合到位點(diǎn),使得后繼配體對(duì)BSA的親和性減弱,即前一個(gè)藥物分子結(jié)合到BSA位點(diǎn)上后,對(duì)后一個(gè)藥物分子與BSA的結(jié)合起到了阻礙作用。隨著溫度的變化,雖然nH變化不大,但也隨溫度升高而降低,說(shuō)明溫度的提升對(duì)CE藥物小分子之間的協(xié)同作用不利。
在Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm 的條件下,測(cè)得CE-BSA 體系的同步熒光光譜見(jiàn)圖7。
圖7 CE猝滅BSA的同步熒光光譜圖Fig 7 Synchronous fluorescence spectrogram of CE quenching BSA
由圖7 可知,隨CE 濃度的增大,這兩種氨基酸殘基的λmax幾乎沒(méi)有發(fā)生移動(dòng),說(shuō)明CE的加入幾乎不對(duì)BSA 構(gòu)象產(chǎn)生影響[11-13]。酪氨酸的猝滅程度大于色氨酸,表明CE 與BSA 相結(jié)合的位點(diǎn)偏向于酪氨酸。
用熒光光譜和紫外吸收光譜法推斷出CE 對(duì)BSA 熒光產(chǎn)生靜態(tài)猝滅,CE 和BSA 之間的作用力類型主要為靜電作用力;CE 與BSA 可形成1 個(gè)結(jié)合位點(diǎn),表明CE 可被BSA 運(yùn)輸;nH<1,表明CE 對(duì)結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生負(fù)協(xié)同作用,即CE 加入使BSA 的親和性增強(qiáng),有利于后續(xù)CE 與BSA 的結(jié)合,結(jié)合部位在BSA 的亞螺旋域ⅡA 中。同步熒光光譜表明CE 幾乎不對(duì)BSA 構(gòu)象產(chǎn)生影響,結(jié)合位點(diǎn)靠近酪氨酸殘基。該研究結(jié)果為了解CE 在體內(nèi)的運(yùn)輸和代謝過(guò)程、毒性機(jī)制提供了重要信息。
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