護理干預對大鼠脊髓損傷后運動功能修復的脊髓形態(tài)學研究

宋碧英，李　巍　(第三軍醫(yī)大學護理學院野戰(zhàn)護理學教研室，重慶 400038)

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護理干預對大鼠脊髓損傷后運動功能修復的脊髓形態(tài)學研究

宋碧英，李巍(第三軍醫(yī)大學護理學院野戰(zhàn)護理學教研室，重慶 400038)

[摘要]目的研究護理干預對大鼠脊髓損傷后脊髓運動功能修復的脊髓形態(tài)學變化。方法將60只SD成年大鼠隨機分為3組，分別為正常對照組、實驗對照組、實驗組，每組20只，每組分4個時相點，即脊髓損傷后1 d、7 d、30 d、60 d(n=5)。實驗對照組和實驗組均采用切割加擠壓脊髓L4平面橫斷制備脊髓損傷大鼠模型。正常對照組為正常大鼠未經(jīng)處理，實驗對照組大鼠脊髓損傷后給予排尿、排便等常規(guī)護理，實驗組除常規(guī)護理之外，還給予關(guān)節(jié)活動度訓練和肌肉按摩訓練，每日2次，每次10 min。采用常規(guī)HE染色、免疫組織化學染色法觀察護理干預對脊髓損傷后大鼠脊髓的形態(tài)學變化。 結(jié)果HE染色結(jié)果以及GFAP和NF-200免疫組織化學染色結(jié)果顯示，實驗組和實驗對照組未見明顯區(qū)別，但與正常對照組比較差異非常明顯。結(jié)論護理干預對損傷區(qū)脊髓組織形態(tài)學研究未見明顯改變。

[關(guān)鍵詞]脊髓損傷；護理干預；大鼠；形態(tài)學；運動功能

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是因各種原因所致脊髓結(jié)構(gòu)和功能的損傷，導致?lián)p傷水平以下脊髓神經(jīng)功能(運動和感覺)障礙[1]。運動功能障礙是導致患者存活期喪失生活自理能力最主要的原因。臨床護理研究顯示，早期運動功能護理干預在臨床護理中結(jié)合常規(guī)護理能促進脊髓損傷患者功能康復。本研究前期實驗結(jié)果[2]也佐證了綜合護理干預可改善脊髓損傷后大鼠運動功能行為學的部分修復，具有延緩肌肉萎縮速度、改善運動功能，促進損傷脊髓功能的部分恢復。為了進一步了解護理干預對脊髓損傷后大鼠神經(jīng)功能恢復的神經(jīng)生物學基礎(chǔ)，探討護理干預是否能引起脊髓損傷處的形態(tài)學結(jié)構(gòu)改變。本實驗對各組各時相點的動物進行了脊髓組織取材，采用HE染色方法和免疫組織化學染色方法，研究護理干預對脊髓損傷后脊髓組織的形態(tài)學變化，尋找臨床實踐中運動康復訓練措施能有效改善脊髓損傷運動功能的脊髓組織修復證據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組

將60只SD成年大鼠(約250 g，雌雄不限)隨機分為3組，即：正常對照組、實驗對照組和實驗組(各組均為n=20)；每組分為4個時相點(各個時相點均取n=5)，即脊髓損傷后1 d、7 d、30 d、60 d。實驗動物均由第三軍醫(yī)大學動物實驗中心提供。

1.2主要儀器

手動輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(湖北康龍電子科技有限責任公司)、37 ℃恒溫箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠)、光學顯微鏡(日本Olympus，顯微圖像分析系統(tǒng))、烤箱(廣州市旭朗機械設(shè)備有限公司)、病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司PHY-Ⅲ)、4 ℃冰箱。

1.3主要試劑

兔抗NF-200抗體購自武漢三鷹公司，兔抗GFAP抗體購自北京博奧森公司，山羊來源封閉血清購自北京中杉公司，抗兔二抗試劑盒購自中杉公司，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidin，DAB)顯色試劑盒購自北京中杉公司。

1.4動物模型制備

正常對照組為正常大鼠，實驗對照組和實驗組均采用切割加擠壓脊髓L4平面橫斷制備脊髓損傷大鼠模型，其具體操作見本課題組應用方法[2]。

1.5護理干預措施

實驗對照組大鼠脊髓損傷后給予常規(guī)護理，實驗組大鼠脊髓損傷后給予護理干預。實驗對照組和實驗組大鼠采取常規(guī)護理，于脊髓損傷后1 d開始進行腹腔注射青霉素鈉20萬U，每日1次，連續(xù)注射3 d以預防感染，協(xié)助受傷大鼠每天2次排尿、排便；實驗組除常規(guī)護理之外，還給予按摩膀胱與腹部、關(guān)節(jié)活動度訓練和肌肉按摩訓練等被動訓練，護理干預均于損傷后立即進行，每日2次，每只大鼠每次10 min。大鼠后肢進行被動關(guān)節(jié)活動訓練，包括膝被動屈伸、膝被動外展內(nèi)收、髖被動屈伸、髖被動外展內(nèi)收、踝被動背屈跖屈等訓練，以維持和改善其關(guān)節(jié)活動度；肌肉按壓訓練主要以向心性和環(huán)形交替按摩足部、小腿、大腿各肌肉群，以減少雙后肢水腫及增加血液循環(huán)。

1.6脊髓組織取材

將正常對照組、實驗對照組和實驗組大鼠于存活1 d、7 d、30 d、60 d后斷頭處死，沿脊柱正中切開皮膚并分離肌肉，暴露脊髓L4水平上下各1 cm處的棘上韌帶并剪去，椎板用咬骨鉗咬去，充分暴露脊髓后，用手術(shù)刀片在脊髓L4水平上下各1 cm處截取損傷的脊髓，入4 ℃的4%多聚甲醛中固定48 h。

1.7觀察指標

1.7.1常規(guī)HE染色各組脊髓組織進行石蠟包埋、修塊，行石蠟切片，各組織塊各取5張石蠟切片，按常規(guī)操作步驟進行HE染色，以觀察護理干預對脊髓損傷后損傷區(qū)大鼠的組織修復情況。

1.7.2免疫組織化學染色取脊髓組織石蠟切片各5張，按SABC免疫組織化學試劑盒說明書進行免疫組織化學染色，GFAP一抗工作濃度為1∶400，NF-200一抗工作濃度為1∶100，以0.02 mol/L PBL(pH7.2)代替一抗作為對照。顯示各組脊髓損傷大鼠各個時相點的神經(jīng)絲蛋白-200(neurofilament-200，NF-200)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的變化，光鏡下觀察脊髓損傷后大鼠經(jīng)護理干預后在各組各時相點中神經(jīng)元的NF-200免疫反應陽性變化和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的GFAP免疫反應陽性變化。

2結(jié)果

2.1HE染色

光鏡下脊髓組織結(jié)構(gòu)HE染色可見，正常對照組脊髓組織結(jié)構(gòu)清晰完整(圖1a)。脊髓損傷后1 d，實驗組(圖1b)和實驗對照組(圖1c)HE染色在脊髓損傷區(qū)均可見出血現(xiàn)象和輕度炎性反應。脊髓損傷后7 d(圖1d、圖1e)，損傷區(qū)脊髓組織結(jié)構(gòu)紊亂，大量炎性細胞浸潤，炎性反應加劇，也可見增生的各種細胞及增生的毛細血管，神經(jīng)元腫脹、壞死，突起消失。脊髓損傷后30 d，實驗組(圖1f)和實驗對照組(圖1g)均可見脊髓損傷區(qū)炎性反應減輕或消失，出現(xiàn)囊腔樣變化或空腔；組織填充處，細胞增生十分明顯，增生細胞有一定方向性，呈簇狀排列，增生的組織中見大量增生的毛細血管。脊髓損傷后60 d，損傷部位脊髓組織結(jié)構(gòu)改善，實驗組(圖1h)和實驗對照組(圖1i)無明顯區(qū)別，可見以損傷區(qū)域為中心形成的比較致密的組織圍繞在空腔周圍，組織細胞排列較有規(guī)律，走行與脊髓縱軸基本一致。

2.2GFAP免疫組織化學染色

光鏡下脊髓組織結(jié)構(gòu)GFAP免疫組織化學染色結(jié)果顯示，正常對照組在脊髓灰質(zhì)中GFAP陽性反應細胞和陽性反應纖維清晰可見；在脊髓白質(zhì)中，GFAP免疫反應陽性細胞和陽性纖維密集，可見GFAP免疫反應陽性細胞星狀突起明顯，細胞多呈不規(guī)則多角形(圖2a)。實驗組和實驗對照組中的GFAP免疫反應陽性細胞表達隨時間的推移而逐漸增多，相同時相點GFAP免疫反應陽性未見明顯差異。脊髓損傷后1 d，實驗組(圖2b)和實驗對照組(圖2c)脊髓損傷區(qū)組織結(jié)構(gòu)紊亂，可見GFAP免疫反應陽性的細胞和纖維，損傷腔隙內(nèi)的組織碎片中見GFAP免疫反應陽性細胞和陽性纖維。脊髓損傷后7 d，實驗組(圖2d)和實驗對照組(圖2e)損傷區(qū)可見散在GFAP免疫反應陽性細胞和陽性纖維，染色較淺，見大量炎性細胞浸潤。脊髓損傷后30 d，實驗組(圖2f)和實驗對照組(圖2g)損傷區(qū)內(nèi)組織GFAP免疫反應陽性表達較7 d時增加，GFAP免疫反應陽性細胞表達和GFAP 陽性纖維表達增加，且GFAP免疫反應陽性纖維交織成網(wǎng)。脊髓損傷后60 d，實驗組(圖2h)和實驗對照組(圖2i)脊髓損傷組織結(jié)構(gòu)紊亂得到改善，損傷區(qū)內(nèi)組織填充，增生區(qū)內(nèi)GFAP 免疫反應陽性細胞和陽性纖維明顯增加，染色加深呈棕褐色并形成膠質(zhì)瘢痕，實驗組與實驗對照組比較無明顯差異。

2.3NF-200免疫組織化學染色

光鏡下脊髓組織結(jié)構(gòu)NF-200免疫組織化學染色結(jié)果顯示，正常對照組(圖3a)NF-200免疫反應陽性細胞分布在脊髓灰質(zhì)中。實驗組和實驗對照組NF-200免疫反應陽性纖維均呈先下降，后逐漸增高的趨勢。脊髓損傷后1 d，實驗組(圖3b)與實驗對照組(圖3c)在脊髓損傷區(qū)組織中和損傷間隙內(nèi)的組織塊中見有NF-200免疫反應陽性細胞和陽性纖維。脊髓損傷后7 d，實驗組(圖3d)與實驗對照組(圖3e)在脊髓損傷組織中NF-200免疫反應陽性細胞和纖維表達較脊髓損傷后1 d明顯下降，見少量NF-200免疫反應陽性細胞和纖維分布。脊髓損傷后30 d，實驗組(圖3f)與實驗對照組(圖3g)NF-200免疫反應陽性表達隨時間推移逐漸增高。脊髓損傷后60 d，實驗組(圖3h)與實驗對照組(圖3i)NF-200免疫反應陽性纖維數(shù)量隨時間推移逐漸增加，在靠近正常脊髓側(cè)NF-200免疫反應陽性纖維交織成網(wǎng)，在增生組織中可見少量NF-200免疫反應陽性纖維。

a:正常對照組；b:實驗組1 d；c:實驗對照組1 d；d:實驗組7 d；e:實驗對照組7 d；f:實驗組30 d；g:實驗對照組30 d；h:實驗組60 d；i:實驗對照組60 d

圖1大鼠脊髓組織縱切面HE染色光鏡觀察(HE ×20)

a:正常對照組；b:實驗組1 d；c:實驗對照組1 d；d:實驗組7 d；e:實驗對照組7 d；f:實驗組30 d；g:實驗對照組30 d；h:實驗組60 d；i:實驗對照組60 d

圖2大鼠脊髓組織縱切面GFAP免疫組織化學染色光鏡觀察( ×20)

a:正常對照組；b:實驗組1 d；c:實驗對照組1 d；d:實驗組7 d；e:實驗對照組7 d；f:實驗組30 d；g:實驗對照組30 d；h:實驗組60 d；i:實驗對照組60 d

圖3大鼠脊髓組織縱切面NF-200免疫組織化學染色光鏡觀察( ×20)

3討論

脊髓損傷后患者常有不同程度的運動功能障礙，恢復運動功能是患者最迫切的需求之一。有研究顯示，運動功能訓練能夠增強脊髓的可塑性，并在一定程度上幫助脊髓損傷患者改善癥狀[3-4]，是脊髓損傷患者神經(jīng)功能恢復的基礎(chǔ)[5]。目前脊髓損傷后功能修復的重點和難點是減少繼發(fā)性損傷，促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性變化、應用阻斷抑制軸突生長的物質(zhì)和刺激神經(jīng)生長促進再生等[6]。中樞神經(jīng)損傷后的繼發(fā)性損傷引起的炎性反應是造成進一步損傷的關(guān)鍵原因[7]。本研究HE染色結(jié)果顯示，實驗組和實驗對照組均于脊髓損傷 1 d時，脊髓損傷區(qū)以出血反應為主；7 d時炎性反應最重；30 d時炎性反應明顯減輕，毛細血管增生明顯。本研究提示運動功能護理干預未能減輕局部炎性反應，尚不能阻止和減輕脊髓損傷后繼發(fā)性脊髓結(jié)構(gòu)和功能的損害。本研究HE染色結(jié)果還顯示，實驗組和實驗對照組均于脊髓損傷 60 d后損傷部位脊髓組織結(jié)構(gòu)改善，損傷部位空腔處有成束神經(jīng)纖維進入填充，灰質(zhì)中可見空腔形成和囊腔樣變化，空腔形成和囊腔樣變化則標志著脊髓損傷進入穩(wěn)定期[8]。本研究提示尚未尋找到臨床實踐中運動功能護理干預能有效改善脊髓損傷運動功能的脊髓病理組織修復證據(jù)。

脊髓損傷修復是一個復雜、多因素共同參與的病理生理反應過程，脊髓組織病理改變過程中各種病理變化引起神經(jīng)元大量丟失和星形膠質(zhì)細胞(astrocyte，AS)的激活與膠質(zhì)纖維化形成局部膠質(zhì)瘢痕，導致患者功能缺失及恢復困難。AS在脊髓損傷修復中起重要作用。AS是最大的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，GFAP是成熟AS中主要的中間絲蛋白，是AS的一種標志性蛋白。GFAP 在損傷脊髓組織中的表達可反映AS增殖、肥大等程度改變，也是衡量膠質(zhì)瘢痕形成和發(fā)展的指標[9]。有研究顯示，AS在脊髓損傷修復的過程中有兩面性作用，在損傷早期增生活躍，構(gòu)成網(wǎng)格框架，并誘導、支持神經(jīng)纖維的再生，參與到損傷后脊髓的神經(jīng)修復[10]；在脊髓損傷后數(shù)天，AS可能轉(zhuǎn)變?yōu)榉磻阅z質(zhì)細胞并形成瘢痕組織，機械性或化學性阻擋神經(jīng)再生[11]。本實驗中，實驗組和實驗對照組在脊髓損傷后1 d，GFAP表達非常強烈，在GFAP 免疫組織化學染色切片中可見大量染成深褐色的GFAP免疫反應陽性細胞和纖維；7 d時降至低谷；隨著時間延長，GFAP陽性表達增加，30 d時AS被激活并呈明顯反應性增生促進神經(jīng)再生[12]；損傷后60 d，脊髓損傷區(qū)GFAP陽性細胞表達呈高峰。上述現(xiàn)象表明，實驗組和實驗對照組在脊髓損傷區(qū)不同時相點，GFAP陽性反應物表達未見明顯差異，而且脊髓損傷后脊髓損傷區(qū)AS明顯功能活躍并膠質(zhì)化，形成膠質(zhì)瘢痕阻礙神經(jīng)纖維生長和再通[13]，提示護理干預不足以影響損傷脊髓組織中GFAP的表達。

正常脊髓組織中的神經(jīng)元(neuron)主要起支配鄰近脊髓節(jié)段的運動、感覺和自主神經(jīng)功能，具有十分重要的作用，神經(jīng)元和AS可作為脊髓損傷后損傷脊髓修復的重要反應[14]。神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)蛋白之一是神經(jīng)絲蛋白(neurofilament protein，NF)，NF行免疫組化染色檢測可提示神經(jīng)元細胞的生長狀態(tài)[15]。NF-200是NF的一種，在脊髓損傷后染色能反映傷后神經(jīng)元的形態(tài)并反映其功能狀態(tài)[16]。本實驗中觀察到，實驗組和實驗對照組NF-200陽性反應物表達均呈先下降，再上升的趨勢；在脊髓損傷后1d，NF-200陽性反應物仍存在表達，提示在脊髓損傷后1 d，神經(jīng)元和神經(jīng)纖維尚未完全變性壞死；脊髓損傷后7 d，NF-200陽性反應物表達降低；脊髓損傷后30 d，NF-200在創(chuàng)傷刺激和多種誘導因子的作用下，積存于胞體，以適應神經(jīng)再生的需要，其表達隨時間推移逐漸增高；脊髓損傷后60 d，NF-200陽性反應物表達增加，在脊髓灰質(zhì)中表達增強。本研究中實驗組和實驗對照組相同時相點NF-200免疫反應陽性物表達未見明顯差異，因此，我們推測護理干預可能不足以影響NF-200陽性反應物在損傷脊髓組織中的表達，或者是我們的研究手段還不夠先進，尚不能檢測出實驗組與實驗對照組之間的差別，可再進一步應用免疫電鏡或分子生物學等研究手段，以研究大鼠脊髓損傷后超微結(jié)構(gòu)和分子水平的變化。

由此可見，護理干預對損傷區(qū)脊髓組織形態(tài)學影響尚未見明顯改變，這可能與護理干預不足以明顯改善脊髓損傷后脊髓組織結(jié)構(gòu)內(nèi)繼發(fā)性損傷，如炎性反應、出血、神經(jīng)膠質(zhì)細胞大量增生、神經(jīng)元損傷后再生十分困難等有關(guān)。本研究尚未找到護理干預促進行為學改變的神經(jīng)生物學證據(jù)。護理干預對脊髓損傷修復的確切機制尚有待進一步研究。

[參考文獻]

[1] Kwon BK，Sekhon LH，F(xiàn)ehlings MG. Emerging repair，regeneration，and translational research advances for spinal cord injury[J].Spine(Phila Pa 1976)，2010，35(21 Suppl):S263-270.

[2] 宋碧英，李巍. 護理干預對大鼠脊髓損傷后運動功能修復的影響[J].局解手術(shù)學雜志，2014，23(3):238-241.

[3] Sarah AD.Activity-dependent plasticity:implications for recovery after spinal cord injury[J].Trends Neurosci，2008，31(8):410-418.

[4] Battistuzzo CR，Callister RJ，Callister R，et al. A systematic review of exercise training to promote locomotor recovery in animal models of spinal cord injury[J].J Neurotrauma，2012，29(8):1600-1613.

[5] Harkema SJ. Neural plasticity after human spinal cord injury: application of locomotor training to the rehabilitation of walking[J]. Neuroscientist，2001，7(5):455-468.

[6] 姚帥輝，鐘德君. 誘導多能干細胞移植在脊髓損傷修復中的應用及研究進展[J].中國脊柱脊髓雜志，2013，23(11):1015-1018.

[7] Osaka M，Honmou O，Murakami T，et al.Intravenous administration of mesenchymal stem cells derived from bone marrow after contusive spinal cord injury improves functional outcome[J].Brain Res,2010,1343(9):226-235.

[8] Li J，Lepski G.Cell transplantation for spinal cord injury: a systematic review[J].Biomed Res Int，2013:786475.

[9] Pekny M， Nilsson M.Astrocyte activation and reactive gliosis[J].Glia，2005，50(4):427-434.

[10] Gimenez Ribotta M，Menet V，Privat A，et al.The role of astrocytes in axonal regeneration in the mammalian CNS [J].Prog Brain Res，2001，132:587-610.

[11] Silver J，Miller JH.Regeneration beyond the glial scar[J].Nat Rev Neurosci，2004，5(2):146-156.

[12] Cheng H，Wu JP，Tzeng SF.Neuroprotection of glial cell line-derived neurotrophic factor in damaged spinal cords following contusive injury[J].J Neurosci Res，2002，69(3):397.

[13] Toyooka T，Nawashiro H，Shinomiya N，et al.Down-regulation of glial fibrillary acidic protein and vimentin by RNA interference improves acute urinary dysfunction associated with spinal cord injury in rats[J].J Neurotrauma，2011，28(4):607-618.

[14] Nakamura M，Okano H.Cell transplantation therapies for spinal cord injury focusing on induced pluripotent stem cells[J]. Cell Res，2013，23(1):70-80.

[15] Uchida A，?olakolu G,，Wang L，et al.Severing and end-to-end annealing of neurofilaments in neurons[J].Proc Natl Acad Sci USA，2013，110(29):E2696-2705.

[16] Uchida K，Baba H，Maczawa Y，et al.Progressive changes in neurofilament proteins and growth associated protein-43 immunoreactivities at the site of cervical spinal cord compression in spinal hyerostotic mice[J].Spine，2002，27(5):480-487.

(編輯：左艷芳)

Spinal cord morphology research of nursing intervention on motor function repair after spinal cord injury in rats

SONG Bi-ying,LI Wei(Department of Military Nursing,Nursing School,Third Military Medical University,Chongqing 400038, China)

Abstract:ObjectiveTo explore the morphology changes of spinal cord after nursing intervention on motor function repair spinal cord injuried rats.Methods60 adult SD rats were randomly divided into normal control group, experimental control group, and experimental group (n=20 for each group). Each group were divided into four time phase points, that is 1 day, 7 days, 30 days and 60 days after spinal cord injury (n=5). The model of L4plane with full transection of spinal cord were made in the rats in experimental control group and experimental group. Normal control group were of untreated normal rats, experimental control group were given routine nursing such as urination and defecation after spinal cord injury, and experimental group were given passive movement practices and muscle massage training twice a day (10 min each time) besides regular nursing. HE staining and immunohistochemistry method were applied to observe the morphology changes of spinal cord.ResultsIn experimental control group and experimental group there was no significant changes in HE staning and NF-200 and GFAP immunohistchemistry staning in spinal cord section of rat at each time phase points, but compared to the normal control group, it was of significant difference.ConclusionThere is no apparent change in morphology in injured spinal area after nursing intervention.

Keywords:spinal cord injury;nursing intervention;rat;morphology;motor function

[收稿日期]2014-08-05[修回日期] 2014-08-19

[通訊作者]李巍，E-mail:weilee2004@yahoo.com

[基金項目]第三軍醫(yī)大學青年基金資助課題(2011xqn14)

doi:10.11659/jjssx.07E014074

[中圖分類號]R744;Q954.52;S854.8

[文獻標識碼]A

[文章編號]1672-5042(2015)01-0018-05