鞍帶石斑魚(Epinephelus lanceolatus)♂×斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)♀雜交子一代青龍斑血液學(xué)及血液生理生化特性的比較研究*

舒 琥 楊麗冬 李 燕 李小梅 侯麗萍 王 吉 張海發(fā)

(1. 廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣州 510006; 2. 廣東省大亞灣水產(chǎn)試驗中心 惠州 516081)

鞍帶石斑魚(Epinephelus lanceolatus)又稱龍膽石斑魚、龍躉, 斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)俗名為青斑, 均隸屬于鱸形目、魚旨科、石斑魚屬(Heemstra et al, 1993; Nelson, 2006), 為海洋暖水性珊瑚礁魚類,同時也是海水養(yǎng)殖中的重要名貴物種。其不僅營養(yǎng)豐富, 肉質(zhì)鮮美, 而且生長迅速, 擁有巨大的市場潛力,深受廣大消費者青睞。其中, 青斑的苗種繁育問題已經(jīng)基本解決, 可以進行大規(guī)模種苗繁育工作。但是,由于在人工養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)種質(zhì)資源退化, 病害頻發(fā)等問題, 人工繁殖龍躉這一難題尚未解決, 目前只能通過捕撈天然苗種來進行龍躉的人工養(yǎng)殖。然而,日益減少的天然海洋資源促使石斑魚的市場價格逐漸提升, 遠不能滿足消費者對石斑魚的需求。因此,本文作者致力于對石斑魚種質(zhì)進行改良, 并希望在繁育養(yǎng)殖石斑魚過程中解決其存在的一系列難題,長期以來, 在廣東大亞灣水產(chǎn)試驗中心開展石斑魚雜交試驗, 以斜帶石斑魚為母本, 鞍帶石斑魚為父本進行種間遠緣雜交, 得到斜帶石斑魚♀×鞍帶石斑魚♂的雜交子一代青龍斑(廣東省大亞灣水產(chǎn)試驗中心, 2010), 子一代肉質(zhì)美、生長快、抗病力強、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn), 具有明顯的優(yōu)勢, 同時在雜交子一代青龍斑群體中發(fā)現(xiàn)了少量三倍體(約 8%), 這些三倍體青龍斑在生長、肉質(zhì)、抗病等方面都表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢, 青龍斑是迄今為止首次在石斑魚類雜交育種得到三倍體個體, 為進一步深入開展石斑魚育種、改良石斑魚種質(zhì)資源狀況打下良好基礎(chǔ)。

迄今為止有關(guān)青龍斑的研究報道較少。有繁養(yǎng)殖、群體遺傳分析等方面的研究(周翰林等, 2012; 呂國敏等, 2013; 王燕等, 2014)。對于青龍斑的血細胞和血液生化指標(biāo)的研究尚未見報道, 而弄清血液學(xué)指標(biāo), 對其病害防治、免疫、生長繁殖等一系列生理生化指標(biāo)檢測具有重大意義。本文通過對其雜交子一代青龍斑二倍體和三倍體血液中的生理生化等指標(biāo)以及紅細胞和白細胞的形態(tài)進行相關(guān)研究, 得出二倍體與三倍體青龍斑的血液指標(biāo)差異, 可為青龍斑二倍體和三倍體的鑒別提供理論依據(jù)。同時可以豐富青龍斑的血液生理學(xué)研究資料, 為石斑魚的遺傳育種提供理論依據(jù)和基本資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗魚均由廣東省大亞灣水產(chǎn)試驗中心提供,以人工培育出的斜帶石斑魚為母本、鞍帶石斑魚為父本進行遠源雜交獲得的子一代青龍斑, 分養(yǎng)在中心水泥池, 2011年5月—2012年5月期間分別隨機選擇體表無傷、發(fā)育正常的健康二倍體與三倍體青龍斑各20尾。二倍體平均體質(zhì)量為(1166.67±622.49)g, 平均體長為(34.50±8.06)cm, 三倍體平均體質(zhì)量(1776.58±422.65)g, 平均體長為(39.67±10.17)cm。

1.2 實驗方法

1.2.1 血細胞比較 用5% EDTA浸潤1mL注射器, 選取身體健康、體表無損的青龍斑, 用 MS-222 (100 mg/L)麻醉后從尾靜(動)脈抽血。采血樣后進行下述指標(biāo)測定:

紅細胞計數(shù): 將血液置于 0.8%的生理鹽水中, 稀釋200倍, 并滴加50μL EDTA標(biāo)準溶液, 混勻, 然后吸取適量血液置于血球計數(shù)板, 于 OLYMPUS-BX51顯微鏡下觀察計數(shù), 每尾魚取4組數(shù)據(jù)的平均值。

紅細胞大小、形態(tài)統(tǒng)計: 先進行瑞氏染色, 將血液在載玻片上推成薄薄一層血膜, 待血膜干后, 瑞氏染色液染色 1min, 加緩沖液混染 5—10min, 蒸餾水緩慢沖洗去染液, 干燥。于OLYMPUS-BX51顯微鏡下隨機選取 10個視野進行觀察并拍照, 每個樣本各測量50個細胞, 取平均值。

白細胞分類計數(shù): 在顯微鏡下觀察每張血涂片并隨機選取其中的 10個視野進行拍照, 對每個視野中出現(xiàn)的各種白細胞進行計數(shù)并分類, 并對各種白細胞所占比例分別進行統(tǒng)計。各種觀測細胞50次測量的平均值即為其細胞的大小。

白細胞、紅細胞及其核的面積和體積按公式S =πa?b/4 和核體積 V = a2?b/1.91 (a 為短軸, b 為長軸)(樓允東, 2009)計算。

1.2.2 血液生化指標(biāo)比較 將采集的血液樣品放置在4°C冰箱靜置4—6h, 4°C條件下以12000 r/min速度離心5—8min, 小心吸取上層血清, 用7170A全自動生化分析儀測定各項生化指標(biāo)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 實驗結(jié)果均采用 Excel和 SPSS 17統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA),Duncan氏檢驗法進行多重比較及t檢驗進行差異顯著性分析, P＜0.05表示差異顯著, P＜0.01表示差異極其顯著。實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準誤(Mean±SE)表示。

表1 二倍體與三倍體青龍斑血液常數(shù)值的比較Tab.1 Comparison of haematological parameters between diploid and triploid Qinglong groupers

2 結(jié)果與分析

2.1 二倍體與三倍體青龍斑血液常數(shù)值的比較

二倍體和三倍體青龍斑血液常數(shù)值的比較見表1, 由表 1可知, 青龍斑的二倍體血液常數(shù)值與青龍斑的三倍體血液常數(shù)值在白細胞、紅細胞、平均血小板體積、平均血細胞體積、血紅蛋白以及紅細胞分布寬度等指標(biāo)中, 二者差異極顯著, 而血細胞壓積和血細胞分布寬度差異顯著, 血小板壓積差異不顯著。其中紅細胞、血紅蛋白和血小板含量隨著倍性升高而降低; 而白細胞、平均血細胞體積、紅細胞分布寬度、平均血小板體積和血小板分布寬度隨著倍性升高而升高。二倍體與三倍體的血細胞指數(shù)在總體上存在顯著性差異。

2.2 二倍體與三倍體青龍斑紅細胞計數(shù)值

從表2可以看出, 青龍斑的二倍體血細胞中的紅細胞數(shù)是 3.53×1011個/L, 三倍體紅細胞數(shù)是 2.33×1011個/L, 二倍體紅細胞數(shù)是三倍體的1.52倍。青龍斑二倍體血細胞中的紅細胞數(shù)明顯多于三倍體紅細胞數(shù)。

表2 二倍體與三倍體青龍斑紅細胞數(shù)量比較Tab.2 Comparison on amount of erythrocyte in diploid and triploid Qinglong groupers

2.3 二倍體與三倍體青龍斑紅細胞及其細胞核的大小

二倍體和三倍體青龍斑紅細胞和細胞核大小測量結(jié)果見表 3, 從表 3可知, 青龍斑的三倍體紅細胞中短徑、長徑、核短徑、核長徑、體積、面積、核面積以及核體積等多項指標(biāo)的數(shù)值均比其二倍體數(shù)值更大。由 t檢驗可知, 在青龍斑的三倍體中, 其紅細胞的短徑、紅細胞核長、紅細胞面積、核體積、長徑及核面積與二倍體間差異極顯著(P＜0.01); 三倍體青龍斑紅細胞體積為二倍體的 1.52倍, 紅細胞核的體積為二倍體的1.59倍, 差異顯著(P＜0.05)。青龍斑三倍體紅細胞短徑/長徑比值為 0.69, 小于二倍體的比值0.79, 從以上數(shù)值中可以看出青龍斑二倍體紅細胞形態(tài)較圓, 而三倍體紅細胞形態(tài)較為狹長。

表3 二倍體與三倍體青龍斑中紅細胞和細胞核大小的對比Tab.3 Comparison in the size of red blood cell and nucleus in diploid and triploid Qinglong groupers

2.4 二倍體與三倍體青龍斑白細胞大小

青龍斑二倍體和三倍體白細胞大小見表 4, 由表4可知, 青龍斑三倍體淋巴細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和單核細胞體積、短徑和長徑等均比二倍體大, 但只有其中的單核細胞的長徑、嗜中性粒細胞、短徑和體積顯著大于二倍體, 其體積比分別為1.59和1.58。

表4 二倍體與三倍體青龍斑白細胞大小比較Tab.4 Comparison in size of leukocyte in diploid and triploid Qinglong groupers (μm)

2.5 二倍體與三倍體青龍斑血細胞形態(tài)比較

2.5.1 紅細胞形態(tài)觀察 在二倍體和三倍體青龍斑的血涂片中, 觀察到數(shù)量最多的細胞是紅細胞, 其中包括成熟的紅細胞、幼紅細胞和原紅細胞, 老化的核影細胞和紅細胞時而出現(xiàn)。而二倍體和三倍體青龍斑血細胞的形狀無明顯差別, 均呈圓形或橢圓形, 但肉眼可見其大小有較大差異。兩種倍性的原紅細胞呈圓形或近圓形, 細胞核呈橢圓型, 居中, 核質(zhì)比大,染色質(zhì)較疏松, 細胞質(zhì)較少(圖 1a, 圖 1b); 圓形或略呈橢圓形的幼紅細胞以及成熟的紅細胞, 它們形狀相似, 往往以群體的形式出現(xiàn), 幼紅細胞的細胞核大于成熟的紅細胞, 呈圓形或橢圓形, 核質(zhì)比較大, 細胞質(zhì)顯著增加, 松散的染色質(zhì)結(jié)構(gòu), 著色淺(圖 1c,圖 1d)。成熟的紅細胞為長橢圓形, 橢圓形的細胞核位于整個細胞中央, 核質(zhì)比較小, 致密的染色質(zhì), 著色為絳紫色(圖 1e, 圖 1f), 衰老的紅細胞及其細胞核比正常的紅細胞大, 疏松網(wǎng)狀的染色質(zhì), 染色為淡紫紅色, 沒有細胞質(zhì)(圖1g, 圖1h)。血影紅細胞似裸核,染色質(zhì)疏松網(wǎng)狀, 染成淡紫色, 無細胞質(zhì)(圖 1i, 圖1j)。在觀察中發(fā)現(xiàn)三倍體血液中存在一些異常形狀的紅細胞, 一般呈紡錘形和月牙形(圖 1s), 這在二倍體紅細胞中是沒有觀察到的。

2.5.2 白細胞形態(tài)觀察 二倍體和三倍體青龍斑的血涂片中觀察到的白細胞包括單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞和淋巴細胞。

淋巴細胞多為圓形、心形(圖 1k, 圖1l), 核染色質(zhì)濃密, 著色較深, 染成紫色。淋巴細胞核較大, 占據(jù)整個細胞大部分面積, 細胞質(zhì)較少, 在細胞核外周僅一窄環(huán)。

嗜中性粒細胞: 呈圓形或者不規(guī)則形狀(圖 1m,圖1n), 細胞核相對于淋巴細胞稍小, 約占細胞的1/3,且形狀各異, 呈馬蹄形, 分葉形等多種形態(tài)。細胞核染色質(zhì)濃密, 著色較深, 染成紅色或紫色, 細胞質(zhì)染色較淺, 顏色為灰藍色。且可以觀察到細胞中有微小藍色顆粒。

嗜酸性粒細胞: 細胞呈圓形(圖1o, 圖1p), 胞質(zhì)內(nèi)充滿粗大、整齊、均勻、緊密, 排列的磚紅色或鮮紅色嗜酸性顆粒, 折光性強。細胞核呈深紫色, 形狀各異通常有 2—3葉分支或者眼鏡型。細胞質(zhì)著色較淺, 呈淡藍色。嗜酸性粒細胞容易破碎, 顆?？煞稚⒂诩毎車?。

單核細胞: 單核細胞一般呈現(xiàn)圓形或近圓形(圖1q, 圖 1r), 細胞核較大, 呈心形, 或者馬蹄形。細胞核染色質(zhì)較為疏松, 著色較淺, 染成藍紫色。細胞質(zhì)染成淡藍色, 且分布著藍紫色顆粒。

2.6 二倍體與三倍體青龍斑紅細胞生化指標(biāo)比較

青龍斑二倍體和三倍體血液生化指標(biāo)的檢測統(tǒng)計結(jié)果見表5。從表5可以看出, 大部分三倍體青龍斑的生化指標(biāo)與二倍體差異明顯。經(jīng)t檢驗, 得出谷丙轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白、球蛋白、總蛋白、總膽汁酸、高密度脂蛋白膽固醇、尿素、肌酐、甘油三酯、鉀以及氯和磷的含量有顯著性差異; 而谷草轉(zhuǎn)氨酶、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、葡萄糖、總膽固醇、鈉和鈣的含量差異不顯著。

3 討論

3.1 青龍斑二倍體與三倍體血液學(xué)特點比較

研究表明, 細胞大小與 DNA的含量或染色體數(shù)目有關(guān), 通常三倍體細胞和細胞核比二倍體的細胞和細胞核要大(Gregory, 2002)。本研究的結(jié)果得出,青龍斑三倍體核體積約等于二倍體核體積的 1.5倍(即三倍體紅細胞體積∶二倍體紅細胞體積 = 3∶2),實際結(jié)果是其紅細胞體積分別為681.05和447.51, 比值為1.52, 隨著倍性增加而增大。與其它魚類一樣(陳俠君等, 2010), 雖然青龍斑三倍體紅細胞的大小顯著大于二倍體的, 但其數(shù)目明顯減少, 同時三倍體紅血細胞核的長軸也明顯增加, 導(dǎo)致三倍體紅細胞多呈橢圓形, 這與舌齒鱸、泥鰍等的結(jié)果一致(Stefano et al,2005; Gao et al, 2007; Del et al, 2011), 由于三倍體與二倍體紅細胞差異顯著, 紅細胞體積大小已成為魚類檢測多倍體的快速、簡便、便宜、有效的方法, 并在多種魚類得到證實(Small et al, 1987; Sezaki et al,1988, 1991; Benfey, 1999; Stefano et al, 2005; Gao et al, 2007; 鄒拓謎等, 2011)。該方法與常用的倍性檢測方法染色體制片及流式細胞儀檢測比較具有如下優(yōu)點: (1) 不需將魚處死, 只需抽少量血制作血涂片即可, 比染色體制片省時省藥省錢; (2) 與流式細胞儀比, 檢測成本低, 不需購買貴重儀器, 這更適合一般科研機構(gòu)和生產(chǎn)單位。

白細胞數(shù)量相對于紅細胞而言, 數(shù)目較少, 且種類不齊全。本文觀察到的白細胞種類數(shù)目的多少依次為淋巴細胞、嗜中性粒細胞、單核細胞以及嗜酸性粒細胞, 而嗜堿性粒細胞則很少見到, 這與張海發(fā)等(2004)報道的結(jié)果基本一致; 白細胞的作用是保護機體, 在機體的免疫反應(yīng)中起著重要的作用(林浩然,2007), 白細胞的數(shù)目差別反應(yīng)魚類抗病和耐受性,作者發(fā)現(xiàn)青龍斑三倍體血細胞中的淋巴細胞和嗜中性粒細胞顯著超過二倍體, 且嗜中性粒細胞和單核細胞的體積顯著大于二倍體, 血液中白細胞含量明顯高于二倍體, 這可能與三倍體抗病能力強有關(guān)。

表5 二倍體和三倍體青龍斑生化指標(biāo)比較Tab.5 Comparison in biochemical index between diploid and triploid Qinglong groupers

3.2 青龍斑二倍體與三倍體血液生理生化特性的比較

作者發(fā)現(xiàn)青龍斑三倍體血紅蛋白含量顯著少于二倍體, 而平均血細胞體積(MCV)、血細胞壓積(HCT)等血液參數(shù)值明顯高于二倍體, 這與對舌齒鱸的研究結(jié)果一致(Stefano et al, 2005), 而與泥鰍等(Gao et al, 2007)結(jié)果相反, 這種異同可能與各物種的特性及其生活環(huán)境的異同有關(guān)。林光華等(1996)發(fā)現(xiàn), 運動活躍的魚類其血液性狀指標(biāo)要比少運動的魚類高,而雜食性魚類低于草食性魚類, 草食性魚類低于肉食性魚類, 因此得出魚類習(xí)性及食性影響其血液性狀指標(biāo)的高低。自然生長的石斑魚生活在珊瑚礁和沙泥底的海區(qū), 快速游泳、肉食性, 青龍斑作為斜帶石斑魚♀×鞍帶石斑魚♂的雜交子一代, 保留雙親的生活習(xí)性; 而泥鰍屬鉆泥沙、底棲、少運動的生活方式; 青龍斑魚血液性狀指標(biāo)正好與其生活習(xí)性特點相吻合。同時三倍體中存在一些如紡錘形和月牙形的異常紅細胞, 可能是由于三倍體的紅細胞存在一些異常無絲分裂造成的, 這也為區(qū)分青龍斑的二倍體與三倍體提供一個判斷依據(jù)。

魚的血液組成包括水、無機成分和有機成分。尾畸久雄(1982)已對魚類血液中的部分無機成分含量進行了歸納總結(jié), 得出了相應(yīng)的范圍: (1) 主要的陰離子: 作為陰離子的主要部分——氯離子, 硬骨魚的含量通常處于 150—180mmol/L之間; 對于磷離子, 已有報道很少, 尚不清楚其合適范圍, 而硫酸鹽和磷酸鹽離子在不同的魚類中存在很大差異。(2) 主要的陽離子: 鈉離子作為血液中陽離子的重要組成部分, 其在硬骨魚中含量為 150—200mmol/L; 鉀離子較少,其含量小于 10mmol/L; 而鈣離子, 不同的魚差別很大, 一般在5mmol/L以下; 鎂略少于鈣。本文實驗結(jié)果得出的二倍體和三倍體青龍斑血液中的各項無機鹽含量均符合上述限定值, 在正常范圍之內(nèi); 但三倍體含量低于二倍體, 這與舌齒鱸的結(jié)果基本一致, 其中原因有待于進一步研究。

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