脂多糖致膿毒血癥大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)觀察*

周　榮　丁曉莉　劉良明

脂多糖致膿毒血癥大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)觀察*

周榮丁曉莉劉良明#

【摘要】目的：觀察細(xì)菌脂多糖(LPS)致膿毒血癥大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)凋亡的器官靶向性及時(shí)相性特征。方法：70只SD大鼠經(jīng)尾靜脈一次性注射LPS(10mg/kg)復(fù)制膿毒血癥模型后平分為30min組、1h組、2h組、4h組、8h組、16h組和24h組。另選10只SD大鼠作為正常對(duì)照組。眼眶采血，ELISA檢測(cè)各組血清中血管性血友病因子(vWF)及炎性介質(zhì)白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的變化特征。斷頭處死對(duì)照組、1h組、4h組和8h組大鼠，取肺、肝、心、腦、腎制作組織切片，采用地高辛標(biāo)記凋亡細(xì)胞，免疫組化染色檢測(cè)上述各組大鼠各臟器VEC凋亡。結(jié)果：2h-24h組TNF-α濃度均較對(duì)照組升高，4h組達(dá)峰值(P<0.01)；IL-1β在2h組和4h組顯著高于對(duì)照組，2h組為峰值(P<0.01)，8h-24h組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。4h-8h組大鼠血清vWF濃度較對(duì)照組升高，4h組達(dá)峰值(P<0.05)，其它時(shí)相組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。LPS致膿毒血癥大鼠肺、肝、心、腦、腎存在不同程度VEC凋亡現(xiàn)象，其中肺部受累較早。結(jié)論：LPS(10mg/ml)所致膿毒血癥大鼠重要臟器可出現(xiàn)VEC凋亡，以肺部較早。

【關(guān)鍵詞】脂多糖；膿毒血癥；內(nèi)皮細(xì)胞；凋亡；大鼠

Observation of Vascular Endothelium Cell Apoptosis in Endotoximia Rat induced by LPS

ZHOU Rong, DING Xiao-li, LIU Liang-ming#

State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, The 2ndDepartment of Research Institute of Surgery, Daping Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400042, China；#Corresponding author

【Abstract】Objective: To evaluate vascular endothelium cell (VEC) apoptosis and its characteristics in lipopolysaccharide (LPS) induced endotoxic model in rat. Method: LPS (10mg/kg) was administered in one bout via caudal vein in 70 rats and then divided randomly into LPS-administered after 30min, 1h, 2h, 4h, 8h, 16h, and 24h group. Another 10 rats was adopted as control group. Blood was collected from orbit. The concentrations of von Willebrand factor (vWF) and interleukin 1β (IL-1β) and tumor necrosis factor α (TNF-α) were detected by ELISA. Rats were sacrificed by decaptitation. The tissue of heart, liver, brain, kidney, lung were collected and made tissue slice. VEC apoptosis of these organs was evaluated with immunohistochemisty staining labeled with digoxin dUTP after LPS was administered. Results: The concentration of TNF-α in serum increased in LPS- administered 2h-24h group compared with the control group, and peaked at 4h group (P<0.01). The concentration of IL-1β in serum also increased in LPS- administered 2h-4h group, peaked at 2h group (P<0.01), and there were no significant difference between 8h-24h and control group respectivly (P>0.05).The concentration of vWF in serum enhanced gradually after LPS in LPS-administered 2h-8h group, peaked at 4h group (P<0.05), decreased in 16h and 24h group compared with 4h group (P<0.05). The apoptosis of VEC from vital organ (lung, heart, brain, kidney and

[作者單位]第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第二研究室，創(chuàng)傷、燒傷及復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042；#通訊作者,Tel：023-68757421；E-mail：liuliangming@yahoo.com

本文2015-07-09收到，2015-09-06修回

liver) occurred after LPS administered for 2-4h, and lung was the most early organ involved. Conclusion: VEC apoptosis occurred in LPS (10mg/ml) induced endotoximia in rat, and lung is the much earlier organ involved.

【Key words】Lipopolysaccharide (LPS)； Endotoximia；Vascular endothelial cell (VEC)；Apoptosis；Rat

血管內(nèi)皮細(xì)胞(Vascular Endothelial Cell, VEC)是各種傷害性刺激(如組織缺血/再灌注、感染等)最先侵犯的部位，是介導(dǎo)膿毒癥/膿毒性休克等臨床重癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵細(xì)胞之一[1]。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)作為革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，可激活機(jī)體炎癥反應(yīng)。LPS通過(guò)Toll樣受體4/2 (TLR4/2)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear Transcriptional Factor-κB，NF-κB)的核移位及炎性介質(zhì)白介素-1β(Interleukin 1β， IL-1β)及腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)等的合成、釋放，由一系列信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程引起機(jī)體循環(huán)血中炎性細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞)及VEC的激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[2,3]。VEC凋亡是膿毒血癥的一個(gè)重要病理環(huán)節(jié)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，血管內(nèi)注射內(nèi)毒素能引起微血管內(nèi)皮損害和VEC脫落[4]；臨床膿毒血癥患者外周血中不但可檢測(cè)到脫落的內(nèi)皮細(xì)胞，且其增加程度與患者死亡率密切相關(guān)[5]。這些資料表明，膿毒血癥時(shí)VEC凋亡和脫落可能與膿毒癥所致微血管滲漏、組織水腫及器官功能衰竭的發(fā)生密切相關(guān)，其在膿毒癥的發(fā)展演變中起著重要作用。本研究經(jīng)大鼠尾靜脈注射LPS致膿毒血癥模型，觀察制模后不同時(shí)間實(shí)驗(yàn)大鼠外周循環(huán)血中炎性介質(zhì)指標(biāo)(TNF-α、IL-1β)和血管性血友病因子(von Willebrand Factor，vWF)水平的變化及不同臟器(肺、肝、心、腦、腎)組織中VEC凋亡現(xiàn)象，初步評(píng)價(jià)經(jīng)靜脈注射LPS致大鼠膿毒血癥時(shí)VEC凋亡的發(fā)生規(guī)律。

1材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 清潔級(jí)SD大鼠80只(200-220g)，雌雄不限，由第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK2002-032)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)主要試劑：LPS(O111∶B4)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)：114M4009V)，實(shí)驗(yàn)時(shí)用生理鹽水溶解。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司(批號(hào)：MK1023)，大鼠TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司(批號(hào)：002859、028514)；大鼠vWF ELISA試劑盒購(gòu)自上海博谷生物科技有限公司(批號(hào)：REV002)；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2　復(fù)制大鼠膿毒血癥模型及分組處理

取70只SD大鼠，實(shí)驗(yàn)前禁食1h，自由進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日經(jīng)尾靜脈一次性注射LPS(10mg/kg)復(fù)制大鼠膿毒血癥模型[6]，隨機(jī)平分為L(zhǎng)PS 0.5h、1h、2h、4h、8h、16h和24h組。另取10只大鼠經(jīng)尾靜脈注射相同體積滅菌生理鹽水(對(duì)照組)。

1.3　樣本采集

各組大鼠經(jīng)眼眶取血1ml后，頸椎脫臼處死，迅速摘取對(duì)照組、1h組、4h組和8h組大鼠心、肝、肺、腦及腎組織。為避免灌注可能帶來(lái)的血管內(nèi)皮損傷，以上臟器均不進(jìn)行灌注沖洗。所有臟器均快速取出并放入預(yù)冷生理鹽水中。心臟組織選取左心室，沿最大縱斷面取材；肝臟選肝右葉縱斷面取材；肺臟選取左肺縱斷面取材；腦組織選左側(cè)大腦，縱斷面取材；腎臟選右腎，縱斷面取材。制成組織塊(厚約2mm)。組織塊在冰浴中清洗后，置4%多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片(5μm)。

1.4　ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-1β及vWF濃度

各組大鼠眼眶取血離心后收集血清，嚴(yán)格按照各指標(biāo)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.5　原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)血管內(nèi)皮凋亡細(xì)胞

取制備好的各組各臟器組織病理切片，采用生物素標(biāo)記的地高辛抗體聯(lián)合鏈酶親和素-熒光素FITC標(biāo)記DNA斷裂片段的3’-OH末端，檢測(cè)凋亡VEC。操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用 PBS 緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照，熒光顯微鏡下凋亡VEC呈黃綠色熒光顆粒。

1.6　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1　各組大鼠TNF-α和 IL-1β血清水平變化

各組TNF-α和 IL-1β水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.372、6.138，P<0.01)。與對(duì)照組比較，2h-24h組大鼠血清TNF-α水平顯著升高，4h組為峰值(t均>2.074，P<0.01)，見(jiàn)圖1。2h組、4h組大鼠IL-1β濃度較對(duì)照組顯著升高，2h組為峰值(t均>2.283,P<0.01)；8h-24h組與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(t均<1.136，P>0.05)。見(jiàn)圖2。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01

2.2　各組大鼠血清vWF水平變化

各組大鼠血清vWF水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.439，P<0.05)。與對(duì)照組比較，4h組和8h組vWF濃度升高(t值分別為2.173和1.969，P<0.05)，4h組達(dá)峰值。0.5h組、1h組、2h組、16h組和24h組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t均<1.098，P>0.05)。見(jiàn)圖3。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.3　各組大鼠各臟器VEC凋亡情況

圖4顯示，對(duì)照組各臟器均未見(jiàn)凋亡VEC。1h、4h和8h組大鼠左肺組織肺泡壁VEC均見(jiàn)黃綠色熒光顆粒，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)，肺泡壁增厚，間質(zhì)水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；4h和8h組大鼠右肝組織VEC亦呈黃綠色熒光染色，但肝血竇間隙未見(jiàn)增加，無(wú)明顯組織水腫；8h組大鼠左心肌組織可見(jiàn)VEC凋亡，且心肌細(xì)胞間隙增加，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；4h和8h組大鼠左腦組織間隙增加，可見(jiàn)VEC凋亡；8h組大鼠右腎組織腫脹，組織間隙增加及水腫，亦見(jiàn)凋亡VEC。

[本文圖4見(jiàn)插2]

3討論

LPS是革蘭陰性細(xì)菌胞壁中的一種成分，是導(dǎo)致嚴(yán)重創(chuàng)傷后全身炎性反應(yīng)綜合癥、器官功能衰竭發(fā)生及機(jī)體死亡的常見(jiàn)原因[7]。VEC作為覆蓋在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)部的單層細(xì)胞，在血管舒縮功能的調(diào)節(jié)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、血液流動(dòng)性的維持及臟器組織血供的保障中發(fā)揮重要作用。膿毒血癥時(shí)，VEC凋亡可引起血管舒縮功能失調(diào)、組織水腫及組織供血不足等多種并發(fā)癥的發(fā)生。

目前采用的大鼠膿毒血癥模型通常是盲腸結(jié)扎穿孔。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠經(jīng)尾靜脈一次性注射LPS(10mg/kg)所致膿毒血癥，觀察其對(duì)重要臟器VEC凋亡的影響。結(jié)果顯示，LPS注射2h后，大鼠血清炎性因子 TNF-α和IL-1β水平較對(duì)照組升高，提示LPS(10mg/kg)經(jīng)尾靜脈注射可誘導(dǎo)大鼠膿毒血癥發(fā)生，其中TNF-α升高時(shí)間持續(xù)更長(zhǎng)，可以作為提示膿毒癥發(fā)生較敏感的指標(biāo)。

基礎(chǔ)研究表明，膿毒血癥患者血清vWF濃度升高[8]，且與VEC功能異常及患者預(yù)后關(guān)系密切[9]；急性肺損傷患者早期血清vWF濃度升高，且與病死率成正比[10，11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，LPS注射后4-8h，大鼠血清vWF顯著升高，16-24h降低至對(duì)照組水平；各組大鼠肺、心、肝、腎、腦組織的VEC均在不同時(shí)相發(fā)生不同程度凋亡(呈黃綠色熒光顆粒)，且多數(shù)器官出現(xiàn)相應(yīng)的細(xì)胞或組織間隙腫脹。其中肺是較早受累的器官。

綜上，經(jīng)尾靜脈注射LPS可誘導(dǎo)大鼠膿毒血癥及VEC凋亡，引起血管內(nèi)皮通透性增加和組織水腫。提示在膿毒血癥早期干預(yù)VEC凋亡的發(fā)生，對(duì)防治嚴(yán)重創(chuàng)傷后血管滲漏、組織水腫及器官功能衰竭有重要意義。

?

周榮(1971-)，女，漢族，醫(yī)學(xué)博士，副研究員，研究方向?yàn)樾菘搜芄δ苷系K發(fā)生機(jī)制及防治

參考文獻(xiàn)

1Opal SM, van der Poll T. Endothelial barrier dysfunction in septic shock[J]. J Intern Med, 2015, 277(3): 277-293.

2Triggle CR, Samuel SM, Ravishankar S, et al. The endothelium: influencing vascular smooth in many ways[J]. Can J Physio Pharmacol,2012,90(6):713-738.

3Zhao QT, Guo QM, Wang P, et al. Salvianic acid A inhibits lipopolysaccharide-induced apoptosis through regulating glutathione peroxidase activity and malondialdehyde level in vascular endothelial cells[J]. Chin J Nat Med,2012,10(1):53-57.

4Cybulsky MI, Chan MK, Movat HZ. Acute inflammation and microthrombosis induced by endotoxin, interleukin-1, and tumor or necrosis factor and their implication in gramnegative infection[J]. Lab Invest,1988,58(4):365-378.

5Mutunga M, Fulton Bullock R. Circulating endothelial cell in patients with septic shock[J]. Am J espir Crit Care Med,2001,163(1):195-200.

6Bannerman DD, Goldblum SE. Mechanisms of bacterial lipopolysaccharide-induced endothelial apoptosis[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2003,284(6):L899-L914.

7Brott DA, Katein A, Thomas H, et al. Evaluation of von Willebrand factor and von Willebrand factor propeptide in models of vascular endothelial cell activation, perturbation, and/or injury[J]. Toxicol Pathol, 2014,42(4):672-683.

8姜福富，覃鋼，韋柳青，等.連續(xù)性靜脈血液濾過(guò)對(duì)膿素癥患者內(nèi)皮功能的作用[J].實(shí)用臨床醫(yī)學(xué)雜志，2011，15(23)：21-23.

9Blann AD. Plasma von Willebrand factor, thrombosis, and the endothelium: the first 30 years[J]. Thromb Haemost, 2006,95(1):49-55.

10Martin K, Borgel D, Lerolle N, et al. Decreased ADAMTS-13 (A disintegerin-like and metalloprotease with thrombospondin typr 1 repeats) is associated with a poor prognosis in sepsis- induced organ failure[J]. Crit Care Med, 2007,35(10):2 375-2 382.

11Flori HR, Ware LB, Milet M, et al. Early elevation of plasma von Willebrand factor antigen in pediatric acute lung injury is associated with an increased risk of death and prolonged mechanical ventilation[J]. Pediatr Crit Care Med,2007,8(2):96-101.

作者簡(jiǎn)介：本文第一

*[基金項(xiàng)目]重慶市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目資助課題(CSTC2009BA5018)

[中圖分類號(hào)]R363.1+4

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1005-1740(2015)04-0007-04

doi：10．3969／j．issn．1005－1740．2015．04．002

微循環(huán)學(xué)雜志，2015，25（4）：7－10

? 2015 CHINESE JOURNAL OF MICROCIRCULATION