紅果肉海棠資源親緣關(guān)系的AFLP分析1)

袁柳祥 李厚華 賈彩霞 徐曼 唐豆豆 劉小微 包努恩都特

(西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌，712100) (武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院) (西北農(nóng)林科技大學(xué))

責(zé)任編輯:潘 華。

蘋果屬植物(Malus)主要分布于北溫帶，其野生種主要分布在東南亞、西亞、東亞、歐洲、北美這5大基因分布中心，我國是蘋果屬植物起源中心之一［1］。海棠是蘋果屬植物中果實(shí)直徑小于5 cm 的類型［2］。海棠中存在著許多果實(shí)的果皮和果肉同為紅色的類型。這些紅色物質(zhì)，主要為花青苷?；ㄇ嘬帐鞘且环N黃酮類色素，具有抗氧化作用［3］，對人體有保健功效。蘋果是深受人們喜愛的水果，位居“功能食品”之首，蘋果中含有大量的蘋果多酚、三萜和植物甾醇、蛋白質(zhì)、糖分、維生素和微量元素等，其中黃酮類化合物是蘋果中含量最高的一類成分［4］，花青苷就是其中一種黃酮類化合物。普通蘋果的花青苷主要來源于果皮中，果肉中幾乎沒有，而人們處于安全等因素的考慮，吃蘋果時(shí)常常將其果皮削去。于是，紅果肉海棠成了一個(gè)新穎的研究材料，通過雜交育種得到紅果肉蘋果新品種，將能滿足人們對蘋果營養(yǎng)與保健功能的需求。雜交育種親本的選擇至關(guān)重要，不僅親本要攜帶有目的基因或目標(biāo)性狀，而且要擴(kuò)大親本間的遺傳差異。傳統(tǒng)育種方法雖然可行，但其受育種家經(jīng)驗(yàn)和時(shí)空的限制比較明顯。利用AFLP 分子標(biāo)記技術(shù)，從DNA 水平上檢測品種及品系間的遺傳差異，不僅能提高品種鑒定的可靠性，更能為雜交育種的親本選擇提供借鑒。

近幾年分子標(biāo)記技術(shù)如SSR［5］、RAPD［6］、AFLP［7］等已經(jīng)廣泛被用于蘋果親緣關(guān)系及遺傳多樣性方面的研究。Dunemann 等［8］運(yùn)用RAPD 標(biāo)記得出矮蘋果(M.pumila)和森林蘋果(M.sylvestris)在栽培蘋果的起源中起作用;王濤等［9］對20 個(gè)重要蘋果砧木建立了AFLP 指紋圖譜，分析了砧木間的親緣關(guān)系，聚類結(jié)果將所試材料聚類為2 個(gè)大組，與前人研究的蘋果砧木系譜一致;梁國魯?shù)龋?0］用AFLP 技術(shù)對蘋果屬23 個(gè)種共31 個(gè)類型分析，驗(yàn)證了傳統(tǒng)分類的正確性，對難以界定的種進(jìn)行了分類。本研究以紅果肉海棠為研究對象，加上部分蘋果栽培種以及蘋果屬野生種作為參照，運(yùn)用AFLP 分子標(biāo)記的方法對30 個(gè)供試材料的親緣關(guān)系以及起源進(jìn)行了探討，為今后分子雜交培育紅果肉蘋果新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

23 份紅果肉蘋果屬植物樣本和6 份對照樣本(見表1)分別采集于西北農(nóng)林科技大學(xué)種質(zhì)資源圃和北京植物園。于春天選取幼嫩葉片，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

雜交育種時(shí)，子代會遺傳父本或母本身上的某些性狀。因此，親本的選擇非常重要。蘋果屬植物的果實(shí)紅色分布類型不同，有的只集中在果核，有的在中果皮外層，有的從表皮到果核全為紅色;紅色深度也從淺紅暈到深紅色不等;果實(shí)大小從最小的不足1 cm 的撒氏到5 cm 以上的新疆野蘋果。因此，從果實(shí)紅色類型、程度，果實(shí)大小等方面對30 份供試材料做出定性測定(表2)。

表1 供試材料

DNA 提取:采用植物基因組DNA 試劑盒提取各試驗(yàn)材料的基因組DNA。提取的DNA 用1%瓊脂糖凝膠檢測純度，用紫外分光光度計(jì)測定DNA 濃度。稀釋DNA 至50 ng/μL，-20 ℃保存。

AFLP 分析:采用Vos et al［11］的方法并稍作改動(dòng)。反應(yīng)程序如下:內(nèi)切酶采用EcoR I 和Mse I 對基因組DNA 進(jìn)行雙酶切，用T4DNA 連接酶進(jìn)行連接，酶切連接一步完成，PCR 儀上37 ℃3 h，得到DNA 稀釋10 倍后用于預(yù)擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增采用Mse I+C/EcoR I+A 引物組合，預(yù)擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃30 s，56℃30 s，72 ℃1 min，24 個(gè)循環(huán);72 ℃10 min。對預(yù)擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物稀釋10 倍，采用能產(chǎn)生清晰條帶的4 種引物組合對稀釋產(chǎn)物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。選擇性擴(kuò)增程序:94 ℃30 s，65 ℃(每次循環(huán)降低0.7℃)30 s，72 ℃1 min，12 個(gè)循環(huán);94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min，24 個(gè)循環(huán);72 ℃10 min，-20 ℃保存。

選擇擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后在體系中加入5 μL Loading buffer 變性緩沖液混勻后，PCR 儀上95 ℃變性8 min，迅速將PCR 管置于冰上以防止復(fù)性，然后冰箱-20 ℃保存。本實(shí)驗(yàn)采用6%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，銀染的方法進(jìn)行檢測。膠板晾干后在X 線膠片觀察燈下觀察記錄并拍照。

聚類分析:對擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果采用“0-1”系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，觀察電泳圖譜中同一位置上AFLP 條帶的有無，有記為“1”，無記為“0”，形成“0/1”矩陣圖輸入計(jì)算機(jī)。采用多變量分析系統(tǒng)(NTSYS2pc，2.10 版)軟件中的SM(simple matching)相似性系數(shù)法計(jì)算遺傳相似系數(shù)，然后根據(jù)相似系數(shù)用非加權(quán)組平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析，并繪制成樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP 擴(kuò)增片段的多態(tài)性

從64 對引物組合中篩選出擴(kuò)增條帶豐富、分辨能力強(qiáng)的4 對引物組合，用這4 對引物對30 份樣品進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出94 條有效條帶，其中多態(tài)性條帶92 條，多態(tài)位點(diǎn)百分率為97.9%(表2)。可見試驗(yàn)樣本具有較高的遺傳多樣性，所有的樣本都可以與其他樣本區(qū)分開。圖1是引物M-CTC/E-AGC對30 份樣本的擴(kuò)增結(jié)果。

表2 4 對AFLP 選擇性擴(kuò)增引物產(chǎn)生的條帶多態(tài)性

2.2 遺傳多樣性聚類分析

從圖2可看出，30 個(gè)植物樣品之間的相似系數(shù)為0.63～0.95。當(dāng)相似系數(shù)為0.65 時(shí)，樣品可劃分為4 組，A 組中包括6 種歐美海棠高原之火、路易莎、秀場、道格、鉆石、紅巴倫以及1 種澳大利亞育種的粉女士紅果皮蘋果。粉女士是澳大利亞用蘋果‘Lady Williams’和‘Golden Delicious’雜交育種得出的優(yōu)良品種。而‘Lady Williams’被認(rèn)為是由歐洲野蘋果(Malus sylvestris)和蘋果(M.domestica)授粉而產(chǎn)生的。粉女士與其他六種歐美海棠聚在同一組，這與以上推測結(jié)果相一致，說明AFLP 分子標(biāo)記技術(shù)能在分子生物學(xué)層面上為物種的起源提供有力證據(jù)。

B 組中包括霍巴、麗絲、雷蒙、瑪瑙、王族、粉芽、紅麗、火焰、完美紫葉、印第安夏天等紅果肉雜交種以及野生種新疆紅肉蘋果、花紅和山荊子。其中，已知霍巴海棠是由新疆紅肉蘋果和山荊子雜交選育得到的第一個(gè)玫紅系列海棠。雷蒙海棠為新疆紅肉蘋果和深紅海棠的雜交后代，麗絲海棠為雷蒙和三葉海棠的雜交后代，王族、紅麗、火焰均為玫紅海棠系列天然雜交的后代。這一組是新疆野蘋果與山荊子雜交得到的玫紅系列的后代。它們的果實(shí)紅色分布(整個(gè)果都是紅色)和紅色程度(大部分都為粉紅)基本相同(見表3)。

表3 材料性狀測定

C 組包括印第安魔力、朱砂、三葉海棠、珠眉海棠、絢麗、凱爾斯、撒氏，其中絢麗、凱爾斯為玫紅海棠系列品種。撒氏海棠最早在日本園林栽培中出現(xiàn)，形態(tài)特征與三葉海棠近似，它與原產(chǎn)中國東部、日本及朝鮮的三葉海棠關(guān)系密切，AFLP 聚類結(jié)果顯示，二者的親緣關(guān)系與之相吻合。珠眉海棠為三葉海棠與近源種雜交的后代，親本未知的印第安魔力、朱砂聚在此組，由此可以推測它們與三葉海棠的親緣關(guān)系比較近，可對將來找到它們的親本及相關(guān)育種有幫助。

D 組包括新疆野蘋果、富士蘋果、嘎啦蘋果。富士是日本以國光為母本，元帥為父本雜交選育出的蘋果優(yōu)良品種。它與嘎啦((元帥×橘蘋)×金冠)和新疆野蘋果聚在一起，它們都是果實(shí)較大的類型(見表3)，進(jìn)一步印證了新疆野蘋果是現(xiàn)代栽培蘋果的祖先的論斷。

圖1 引物M-CTC/E-AGC 組合對供試樣本的AFLP 擴(kuò)增圖譜

圖2 30 個(gè)供試樣本AFLP 分析聚類樹狀圖

3 結(jié)論與討論

本研究中親緣關(guān)系較近的品種緊密的聚在一起，而且具有相同親本起源的品種相似系數(shù)極高。如市場上常見的嘎拉((元帥×橘蘋)×金冠)和富士(國光×元帥)，他們都有相同的親本“元帥”，他們的相似性系數(shù)為0.927 5，與劉鳳之［12］(2007)用SSR 分子標(biāo)記得出的聚類分析結(jié)果(相似度系數(shù)為0.890 3)一致。“麗絲”(M.‘Liset’)是雷蒙和三葉海棠的雜交種，它既有雷蒙的某些特征，又和三葉海棠具有一定的相似性。但在本次聚類中，麗絲與其親本之一雷蒙‘Lemoinei’聚在一起，他們的相似系數(shù)為0.768 1，而與另外一個(gè)親本三葉海棠相對較遠(yuǎn)，相似系數(shù)為0.681 2，這與趙天田等［13］人在研究海棠單株親本鑒定時(shí)得出的一些雜交種在聚類時(shí)有向母本聚類的趨勢的結(jié)論相一致。

雜交育種是一種重要植物育種方式，親本遺傳距離的遠(yuǎn)近對雜交育種的結(jié)果影響很大［14］，如果兩個(gè)親本遺傳距離過大，可能會因?yàn)榉N間不親和性而導(dǎo)致雜交不育現(xiàn)象發(fā)生，選擇親緣關(guān)系相近的親本作為育種材料能大大提高雜交育種成功率。AFLP 標(biāo)記從分子水平對植物進(jìn)行聚類，對植物親緣關(guān)系的分析比較準(zhǔn)確可靠，可以在判斷親本遺傳距離時(shí)提供幫助，為雜交育種親本選擇提供依據(jù)。例如，山荊子作為一種良好的砧木，具有根系發(fā)達(dá)，抗病性好等優(yōu)點(diǎn)，若想培育一種具有良好抗性的彩色葉紅果肉海棠新品種，可參考圖2的分子標(biāo)記聚類分析結(jié)果，選擇與山荊子遺傳相似性高的彩色葉紅果肉‘王族’海棠作為親本與山荊子進(jìn)行雜交，提高其育種成功率。

通常認(rèn)為“絢麗”海棠是霍巴海棠天然雜交的結(jié)果，但是在本聚類中，絢麗卻沒有和其母本霍巴海棠聚在一組，這種現(xiàn)象可能是因?yàn)槠渑c未知的父本的親緣關(guān)系近似，它和印第安魔力、朱砂、三葉海棠、珠眉海棠、凱爾斯、撒氏一同被聚類在C 組，所以，絢麗海棠的父本可能與C 組中基因近似。當(dāng)然，另外一種解釋是絢麗不是霍巴海棠天然雜交的結(jié)實(shí)后代，因此，需要進(jìn)一步的研究來闡明絢麗海棠的起源。另外，王族和紅巴倫由于樹形近似，枝條開展角度狹窄，枝葉繁密，都具有深紫色葉和光滑枝條，果肉的顏色也都是深紅色。雖然他們常被人們混淆，但是用分子標(biāo)記可以很好地將二者區(qū)分開，因此，AFLP 分子標(biāo)記可以為形態(tài)易混淆種或品種的辨認(rèn)提供可靠依據(jù)。

新疆的野生蘋果在世界蘋果屬植物的起源中起著極其重要的作用。Ponomarenko［15］及Janick［16］認(rèn)為中亞地區(qū)(包括哈薩克斯坦、烏茲別克斯坦、中國新疆地區(qū)等)是栽培蘋果的起源中心，并提出新疆野蘋果是栽培蘋果祖先。俞德浚［17］將新疆野蘋果(Malus sieversii)列入真蘋果組(Eumalus Zabel)的蘋果系(Pumilae Rehd.)，首次賦予新疆野蘋果在蘋果屬中的分類地位。在本實(shí)驗(yàn)中，新疆野蘋果和栽培蘋果富士、嘎啦共同聚在D 組，印證了新疆野蘋果是栽培蘋果祖先這一論斷。本研究中的紅果肉蘋果的親本在先前都有記載［18-19］。根據(jù)記載，幾乎所有紅果肉海棠變種都可以追溯至新疆紅肉野蘋果(Malussieversiif.neidzwetzkyana (Dieck)Langenf)。本次聚類分析，許多紅果肉海棠都和新疆紅肉蘋果聚為一組，如霍巴、雷蒙和麗絲等，這驗(yàn)證了新疆紅肉蘋果是現(xiàn)代紅果肉海棠起源的觀點(diǎn)。新疆紅肉蘋果紅色芽，開單花紅色，約4～5 cm，果實(shí)紫紅色，果肉紅色，果徑約5～6 cm，發(fā)現(xiàn)于中國邊界的天山，新疆紅肉蘋果的無性繁殖苗給現(xiàn)代海棠帶來了的巨大變化，它的嫩葉、芽、花、果(包括果肉)、枝干均為紅色，因?yàn)樗?dú)特的顏色，被大量用于雜交。從單獨(dú)的樣本來看，雖然本次聚類中新疆紅肉蘋果與新疆野蘋果未聚在同一組，有一定差異，但大部分品種的遺傳相似性系數(shù)都在0.68 以上，總體上比較近，因此以紅果肉海棠與當(dāng)前的栽培蘋果品種為親本進(jìn)行雜交育種在克服雜交不親和性方面具有明顯的優(yōu)勢。

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