牛FABP3轉基因小鼠的遺傳及表達特性研究

李 娟，杜新華，陳 燕，高 雪，李俊雅，許尚忠

（中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193）

在肉牛育種工作中，培育出肉質好、營養(yǎng)價值高的肉牛品種是育種工作者努力的方向。脂肪酸結合蛋白3（Fatty acid binding protein 3，F(xiàn)ABP3）作為與動物肌內脂肪沉積相關的候選基因得到了廣泛關注。研究表明，該基因SNPs位點與哺乳動物的背膘厚、大理石花紋、剪切力等脂肪沉積相關性狀存在顯著差異［1-2］。因此，開展FABP3基因特性研究對優(yōu)質肉牛新品種的培育具有重要指導意義。

FABP3基因是脂肪酸結合蛋白基因家族的一員，主要分布在動物的心肌和骨骼肌細胞中［3］，參與脂肪酸的轉運，促進脂肪酸的合成，對脂肪的沉積、轉運及基因的轉錄具有重要作用［4-5］。FABP3可結合和轉運長鏈脂肪酸，促進心肌和骨骼肌細胞中甘油三酯的沉積，被視為影響肌內脂肪含量的重要候選基因［6］。在家畜育種中主要集中在FABP3基因多態(tài)位點與性狀之間的關聯(lián)分析。F.Gerbens等［1，7-8］證明豬FABP3基因是影響肌內脂肪的候選基因。Z.G.Huang等［9］報道肉羊FABP3的mRNA表達與肌內脂肪含量呈正相關；余剛等［10-12］報道，F(xiàn)ABP3基因與陜北白絨山羊的背膘厚、大理石花紋間存在極顯著相關性。李武峰等［13］發(fā)現(xiàn)肉牛FABP3基因位點與牛肉嫩度剪切力顯著相關，王卓和昝林森［14］發(fā)現(xiàn)，秦川牛FABP3基因與后腿圍、背膘厚、嫩度、大理石花紋等性狀存在極顯著相關。因此將該基因作為肌內脂肪沉積的候選基因來尋找改善肉品質的方法，仍有大量的工作需要繼續(xù)［15］。

小鼠作為重要的模式動物已得到廣泛應用，其基因組改造技術成熟，且生理生化特點和發(fā)育過程與家畜相似；另一優(yōu)點是小鼠作為遺傳學研究材料其基因組計劃已完成，為研究基因功能及其表達調控的分子機制提供了條件基礎和技術手段。1982年，Palmiter實驗室產生的“超級轉基因鼠”首次證明了轉基因鼠的可行性；2001年，塞萊拉公司宣布完成了小鼠基因組測序的草圖，這極大促進了小鼠作為重要轉基因模型的發(fā)展［16］。

在基因水平研究FABP3基因對牛等家畜脂肪代謝的調控機理仍處于探索中，將牛的FABP3基因轉入小鼠體內，并驗證其功能，是牛功能基因在模式動物體內驗證的一種有效方法。本研究主要對轉牛FABP3基因的小鼠及其子代進行驗證，并檢測目的基因在小鼠體內的遺傳情況；同時，利用熒光定量和組織熒光技術驗證小鼠不同組織中FABP3基因表達水平，以期探明轉牛FABP3基因小鼠的遺傳與表達特性，為牛FABP3基因功能研究奠定基礎，也為牛的分子遺傳育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究采用杜新華博士（2013年）在中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所利用C57BL／6J品系供體鼠和公鼠獲得的受精卵，通過顯微注射質粒PB［CMV-EGFP-FABP3］和輔助質粒pcDNA-pBase制備得到的4只轉基因小鼠2雄（編號1、2號）2雌（編號3、4號），另外購得非轉基因個體5只（C57BL／6J品系）作為對照組，1雄4雌［17］。制定交配方案為第1組：1號♂轉基因鼠與3號♀轉基因鼠交配；第2組：2號♂轉基因鼠與4號♀轉基因鼠交配；第3組：1號♂轉基因鼠與野生型雌性交配；第4組：2號♂轉基因鼠與野生型雌性交配；第5組：野生型個體自由交配作為對照組。

1.2 方法

1.2.1 G0代轉基因小鼠RT-PCR驗證 將獲得的4只轉基因小鼠進行活體成像，確認為陽性個體；另外取10～20 mg鼠尾，按照天根動物組織總RNA試劑盒的步驟提取鼠尾總RNA。RT-PCR反應：（1）RNA變性，反應體系：Oligod T Primer 1 μL、d NTP（10 mmol·L-1）1μL、總RNA 2μL、加RNase free dd H2O至10μL；將反應液置于65℃保溫5 min，迅速置于冰上；（2）反轉錄，反應體系：上述變性反應液10μL、5×PrimeScript II Buffer 4.0 μL、RNase Inhibitor（40 U·μL-1）0.5μL、Prime-Script II RTase（200 U·μL-1）1.0μL、RNase free dd H2O補至20μL，42℃反應30～60 min，95℃滅活5 min，置于冰上冷卻，轉錄后的cDNA于-20℃保存；（3）PCR擴增，以上述反應得到的c DNA為模板，以FABP3-F：5′-CCGGAATTCGCCACCATGGTGGACGCCTTC-3′，R：5′-CGCGGATCCTGCCTGTTTCTCGTA-3′為引物擴增FABP3基因。PCR反應體系：反轉錄的cDNA稀釋10倍后取1.0 μL、d NTP（10 mmol·L-1）2.0μL、10×PCR Buffer（Mg2＋plus）2.0μL、Primer（10μmol·L-1）各0.5μL、Taq DNA酶0.5μL、加入dd H2O調至20 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。電泳檢測轉基因小鼠RNA表達情況。

1.2.2 G1代轉基因小鼠陽性檢測 提取4只G0代轉基因小鼠基因組DNA作為轉基因陽性個體對照，提取G1代個體基因組DNA。步驟如下：剪取G1代小鼠鼠尾1 cm左右，根據試劑盒OMEGA Genomic DNA Isolation Kit步聚提取基因組DNA；利用Primer primer5軟件設計引物擴增牛FABP3 基因，其上游引物為 F：5′-AGCAGAAGAACGGCATCA-3′；下游引物為R：5′-TTGTGGTAGGCTTGGTCATA-3′。PCR擴增反應體系：DNA模板1.0μL、10×PCR Buffer（Mg2＋plus）2.0μL、d NTP（10 mmol·L-1）0.4μL、正反向引物各0.6μL、Taq DNA酶0.2μL、補dd H2O至20μL；擴增程序：預變性95℃5 min；35個循環(huán)：94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min；最后，72℃延伸5 min。擴增結束，電泳檢測陽性條帶的PCR產物送上海生工生物技術有限公司進行測序；然后，通過BLAST搜索比對以確定轉基因小鼠的遺傳情況。1.2.3 G1代轉基因小鼠FABP3表達水平檢測

為了驗證牛FABP3基因在小鼠體內的表達水平，以及該基因與營養(yǎng)調控的共同作用下FABP3表達量的變化。選取第1組G1代陽性個體2只、第2組1只、第3組1只、第4組1只、G0代個體1只、非轉基因個體4只作為陰性對照，利用熒光定量PCR檢測牛FABP3在轉基因小鼠子代心和骨骼肌中的表達水平。提取小鼠組織總RNA，電泳檢測18S、28S條帶清晰后，將RNA反轉錄，以小鼠β-actin基因為內參，利用Primer primer5軟件分別設計引物（表1）。每個樣品3個重復；相對表達量的計算采用2-ΔΔCT法，結果用“平均值±標準誤”表示，并采用鄧肯式新復極差檢驗法（DMRT法）進行表達量差異分析。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used in the Real-time PCR amplification

1.2.4 組織原位表達鑒定 選取G0代轉基因小鼠1只，G1代轉基因小鼠2只，非轉基因小鼠2只處死后，采集心、肝、腎、背部骨骼肌組織置于液氮速凍后，放入-80℃冰箱中保存待用。切片制備：切片機打開預冷2 h，使切片機的箱體溫度達-18℃，刀頭溫度達到-20℃。將切片機的載物托涂上一層包埋劑待其冷凍后，將包埋劑的上端削平，每只小鼠取合適大小相同的組織部位，置于載物托上，包埋劑包埋待用，將載物托安裝到刀頭，調試刀頭后開始切片，設置切片厚度為6μm。將切片置于熒光正置顯微鏡下100倍放大視野中觀察綠色熒光蛋白表達情況。

2 結 果

2.1 轉基因個體及后代的陽性驗證

2.1.1 G0代轉基因小鼠的陽性驗證 本研究所用轉基因載體攜帶EGFP，因此，在熒光燈照射下，4只G0代轉基因小鼠爪子及尾根部被毛覆蓋較少的地方可以看到綠色熒光（圖1左）。轉基因小鼠1、2、3、4號個體RT-PCR電泳結果表明，位于大約400 bp的位置有明顯的擴增條帶（圖1右），與目標基因片段大小相符，說明4只小鼠是轉基因陽性個體，且牛FABP3基因在小鼠體內表達。

2.1.2 G1代轉基因小鼠DNA水平陽性檢測應用交配方案，4組G0代小鼠交配共產生G1代仔鼠28只；提取G1代小鼠基因組DNA擴增后，電泳檢測共獲得19只陽性個體（圖2）。轉基因小鼠子代陽性率的檢測結果表明，第1組G1代個體的陽性率最高（100%），第4組次之（75%），第2組為55.6%，第3組最低（42.8%）（表2）。表明4只G0代轉基因陽性小鼠個體可將目的基因遺傳給后代，但轉基因小鼠的后代遺傳比例存在差異。

圖1 4只轉基因小鼠陽性檢測Fig.1 The positive detecting on 4 transgenic mice

表2 轉基因小鼠各組陽性率比較Table 2 Comparing the positive rate of genetic modified mice among different groups

圖2 轉基因小鼠子代個體基因組DNA鑒定Fig.2 PCR detection of genetic modified mice

2.1.3 陽性個體的測序結果 通過PCR擴增電泳為陽性后，測序，顯示所得到的序列全部個體一致，F(xiàn)ABP3序列信息：AGCAGAAGGACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCT-CGGCATGGACGAGCTGTACAAGTCCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCGCCACCATGGTGGACGCCTTCGTGGGTACCTGGAAGTTAGTGGACAGCAAGAATTTCGATGACTACATGAAGTCACTCGGTGTCGGTTTTGCTACCAGGCAGGTGGGCAATATGACCAAGCCTACCACAAA。

圖3 FABP3轉基因序列搜索比對Fig.3 BLAST results of the transgene sequence FABP3

序列BLAST軟件搜索比對如圖3，結果表明，該序列前314個堿基與載體EGFP-C1序列的相似度達99%，而后127個堿基與牛FABP3的m RNA序列對比一致性達100%，因此，本試驗進一步證明攜帶牛FABP3基因的質粒轉入了小鼠的基因組DNA中，且能夠遺傳給下一代。

2.2 轉基因子代小鼠FABP3 mRNA表達差異

轉基因子代小鼠RT-PCR檢測結果表明（表3、表4），相對于陰性對照組而言，在心肌中轉基因小鼠FABP3的表達增加量在1～1.7倍，骨骼肌中目的基因的相對表達增加量在1～3倍，其中2號個體的總FABP3基因的表達增加量達3.21倍。在G1代轉牛FABP3基因小鼠陽性個體中，1、2號小鼠在心肌和骨骼肌中的表達量都比較高，尤其是骨骼肌中相對陰性對照個體表達量達到3倍以上，通過鄧肯式新復極差檢驗均表現(xiàn)差異極顯著（P＜0.01）；3號小鼠心肌和骨骼肌中的表達量也較高，通過DMRT檢驗在骨骼肌顯著表達（P＜0.05）；第4只是轉基因小鼠雄性與非轉基因小鼠雌性交配所生的后代，相對于陰性對照外源基因在小鼠心和骨骼肌中的表達量差異不顯著；第5只小鼠與第4只小鼠都是轉基因雄性個體與非轉基因雌性小鼠的后代，外源基因的表達量沒有明顯的增加（圖4）；第6只小鼠為G0代，其表達量低于G1代個體，這可能與飼喂的日糧不同有關。

表3 牛FABP3基因在小鼠不同個體心肌中實時熒光定量PCRTable 3 RT-qPCR results of FABP3 gene in mice heart muscle

表4 牛FABP3基因在小鼠不同個體骨骼肌中實時熒光定量PCRTable 4 RT-qPCR results of FABP3 gene in mice skeletal muscle

2.3 組織原位表達

GFP是一種綠色熒光蛋白，它作為標記載體可以更直接的在熒光顯微鏡下觀測轉基因個體是否轉入成功，因此對轉基因個體進行了直接切片檢測。

對G0代轉基因小鼠不同組織的綠色熒光蛋白進行熒光檢測，轉基因個體的載體不可能均勻分布在小鼠體內，因此轉基因個體的組織出現(xiàn)了許多的小亮斑。結果表明（圖5），心肌中的熒光蛋白出現(xiàn)的亮斑相對較多，如圖5A1中的箭頭所指呈現(xiàn)綠色熒光斑點；肝中的表達量最低（圖5A2）；腎（圖5A3）中的熒光點也比較多，證明攜帶目的基因的載體EGFP蛋白存在于G0代轉基因小鼠體內并得到了有效表達。

G1代小鼠切片中（圖5，B1～B4）GFP蛋白仍有表達，但是亮斑的數(shù)量相對G0代明顯有所減少。G1代中GFP蛋白的表達量最高的為骨骼肌、其次是心肌、腎、肝。證明轉基因小鼠所攜帶的熒光蛋白可以通過繁殖遺傳給后代，陰性對照個體可以看出細胞的分布，屬自身熒光，沒有出現(xiàn)GFP蛋白的熒光亮斑，且在熒光顯微鏡下觀測時，自身熒光很快會被淬滅。

圖4 牛FABP3基因在小鼠心肌和骨骼肌中的表達量柱狀圖Fig.4 The histogram of FABP3 expression of cattle in transgenic mice myocardial and skeletal muscle

圖5 G0、G1代轉基因陽性個體與陰性對照個體心、肝、腎、骨骼肌組織切片熒光比較100×Fig.5 The fluorescence detection of heart，liver，kidney，skeletal muscle in G0 and G1 generation 100×

3 討 論

轉基因動物的陽性鑒定及基因表達的研究是轉基因動物后續(xù)功能驗證的基礎。本研究驗證了轉牛FABP3基因小鼠遺傳表達情況，發(fā)現(xiàn)牛FABP3基因可以被整合入小鼠基因組，并遺傳給子代，但不同的子代基因表達受到一定影響；不同交配組合其子代陽性率差異也較大，第一組個體中的遺傳性較好，其陽性率達到100%，這可能與目的片段的插入位點和整合位點有一定關系［18］，需要通過染色體步移或者基因捕獲等技術進行檢測。

FABP3基因是影響脂肪沉積的關鍵基因，其表達上調時脂肪吸收和代謝能力增強，促進心肌和肌肉細胞中甘油三酯的沉積，從而增加肌內脂肪的含量［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，在轉基因小鼠不同組織中FABP3蛋白沉積存在較大差異，骨骼肌和心肌中總FABP3表達量較高，這與之前B.P.Atshaves等報道的FABP3促進心肌中脂肪的沉積結果相一致［20］；說明高油對FABP3表達起調控作用。本研究在m RNA水平檢測了一只G0代個體的FABP3表達，可能個體間存在差異，其表達量偏低。在組織表達檢測中，發(fā)現(xiàn)GFP蛋白在G1代中的表達明顯少于G0代，這可能是外源基因在轉基因動物及其子代中常常發(fā)生拷貝數(shù)丟失和表達沉默的現(xiàn)象［21］。

文獻報道FABP3基因主要分布在心肌和骨骼肌細胞中，且參與心肌和骨骼肌的脂肪代謝［22-23］，因此，在心肌和骨骼肌中的表達量較高。心肌中FABP3基因表達量過高會造成心肌損傷或細胞線粒體代謝紊亂，并誘發(fā)細胞凋亡［24］。在本研究中，飼養(yǎng)的小鼠健康狀況良好，但是G0代小鼠的繁殖性狀不穩(wěn)定，產子率較低，且易出現(xiàn)死胎等，這可能與FABP3轉座子、載體插入小鼠基因組后對小鼠整體生產性能有影響，需待進一步驗證。

4 結 論

本研究檢測了牛FABP3基因在模式動物小鼠體內的遺傳與表達特性，并通過繁殖后代驗證了牛FABP3轉基因小鼠的遺傳性，F(xiàn)ABP3基因的小鼠可以攜帶外源基因遺傳。后期還需要對轉基因小鼠遺傳穩(wěn)定性方面繼續(xù)進行研究，對遺傳穩(wěn)定個體進行分子水平和蛋白質水平的驗證，為肉牛育種工作積累有價值基因。

（

）：

［1］ GERBENS F，VAN ERP A J，HARDERS F L，et al.Effect of genetic variants of the heart fatty acid-binding protein gene on intramuscular fat and performance traits in pigs［J］.J Anim Sci，1999，77（4）：846-852.

［2］ MORGAN J B，SAVELLl J W，HALE D S，et al.National beef tenderness survey［J］.J Anim Sci，1991，69（8）：3274-3283.

［3］ ZANOTTI G.Muscle fatty acid-binding protein［J］.Biochim Biophys Acta，1999，1441（2-3）：94-105.

［4］ DAY C.Metabolic syndrome，or what you will：definitions andepidemiology［J］.Diab Vasc Dis Res，2007，4（1）：32-38.

［5］ ZHANG Y，KENT J W，LEE A，et al.Fatty acid binding protein 3（FABP3）isassociatedwithinsulin，lipids and cardiovascular phenotypes of themetabolic syndrome through epigenetic modificationsin a northern european family population［J］.BMC Med Genomics，2013，19，6：9.doi：10.1186／1755-8794-6-9.

［6］ 馮愛娟，陳東風.脂肪酸結合蛋白研究進展［J］.世界華人消化雜志，2003（9）：1457-1459.FENG A J，CHEN D F.Fatty acid binding protein are reviewed［J］.World Chinese Journal of Digestology，2003（9）：1457-1459.（in Chinese）

［7］ GERBENS F，DE KONING D J，HARDERS F L，et al.The effect of adipocyte and heart fatty acid binding protein genes on intramuscular fat and back fat content in Meishan crossbred pigs［J］.J Anim Sci，2000，78（3）：552-559.

［8］ GERBENS F，VERBURG F J，VAN MOERKERK H T，et al.Associations of heart and adipocyte fatty acid-binding protein gene expression with intramuscular fat content in pigs［J］.J Anim Sci，2001，79（2）：347-354.

［9］ HUANG Z G，XIONG L，LIU Z S，et al.The developmental changes and effect on IMF content of H-FABP and PPARgamma m RNA expression in sheep muscle［J］.J Genet Genomics，2006，33（6）：507-514.

［10］ 余 剛，羅 軍，薛 瑞，等.陜北白絨山羊H-FABP基因多態(tài)性及其與部分生產性能的相關研究［J］.安徽農業(yè)科學，2007a，（28）：8880-8881.YU G，LUO J，XUE R，et al.Study on polymorphisms of H-FABP gene and its relation with growth and carcass traits in Northern Shaanxi white cashmere goat［J］.Journal of Anhui Agricultural Sciences，2007a，（28）：8880-8881.（in Chinese）

［11］ 余 剛，羅 軍，韓雪峰，等.陜北白絨山羊H-FABP基因SNPs及其與生長、胴體性狀的相關研究［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2007，38（11）：1154-1159.YU G，LUO J，HAN X F，et al.Study on SNPs of HFABP gene and its relationship with growth and carcass traits in shanbei white cashmere goats［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2007，38（11）：1154-1159.（in Chinese）

［12］ 余 剛.陜北白絨山羊H-FABP基因內含子3的遺傳多態(tài)性分析［J］.中國草食動物，2010（1）：5-8.YU G.Analysis on the genetic polymorphism at the intron 3 of H-FABPgene in shanbei white cashmere goats［J］.China Herbivores，2010（1）：5-8.（in Chinese）

［13］ 李武峰，許尚忠，曹紅鶴，等.3個雜交牛種H-FABP基因第二內含子的遺傳變異與肉品質性狀的相關分析［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2004，35（3）：252-255.LI W F，XU S Z，CAO H H，et al.Genetic variation in intron2 of H-FABPgene in three bovine hybrids and the relationships with meat quality traits［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2004，35（3）：252-255.（in Chinese）

［14］ 王 卓，昝林森.秦川牛H-FABP基因第1外顯子SNP及其與部分肉用性狀相關性的研究［J］.西北農林科技大學學報（自然科學版），2008，36（11）：11-15.WANG Z，ZAN L S.Study on SNP of H-FABPgene extron1and its association with some meat traits in Qinchuan cattle［J］.Journal of Northwest A ＆F U-niversity（Natural Science Edition），2008，36（11）：11-15.（in Chinese）

［15］ MORENO-SANCHEZ N，RUEDA J，MARIA J，et al.Skeletal muscle specific genes networks in cattle［J］.Funct Integr Genomics，2010，10（4）：609-618.

［16］ 馬 微，趙 偉.后基因組時代轉基因小鼠在生命科學中的研究進展［J］.醫(yī)學綜述，2011，17（9）：1286-1289.MA W，ZHAO W.Research progress of trangsgenic mice in post-genomic era in life science［J］.Medical Recapitulate，2011，17（9）：1286-1289.（in Chinese）

［17］ 杜新華.PiggyBac轉座子介導的脂肪代謝相關基因的轉基因功能研究［D］.北京：中國農業(yè)科學院，2013.DU X H.Transgenic research of fat metabolism genes mediated by piggybac transposon［D］.Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences，2013.（in Chinese）

［18］ 杜新華，高 雪，張路培，等.piggyBac轉座子在?；蚪M的整合位點及特征分析［J］.遺傳，2013，35（6）：771-777.DU X H，GAO X，ZHANG L P，et al.Integration sites and their characteristic analysis of piggyBac transposon in cattle genome［J］.Hereditas，2013，35（6）：771-777.（in Chinese）

［19］ BONEN A，LUIKEN J J，LIU S，et al.Palmitate transport and fatty acid transporters in red and white muscles［J］.Am J Physiol，1998，275（3 Pt 1）：E471-E478.

［20］ ATSHAVES B P，MARTIN G G，HOSTETLER H A，et al.Liver fatty acid binding protein and obesity［J］.J Nutr Biochem，2010，21（11）：1015-1032.

［21］ 孔祥平，吳慶洲.復制型HBV轉基因小鼠遺傳穩(wěn)定性研究［J］.中國生物工程雜志，2008，28（5）：17-21.KONG X P，WU Q Z.Thegenetic stability of replicating HBV transgenic mice［J］.China Biotechnology，2008，28（5）：17-21.（in Chinese）

［22］ CHO S，PARK T S，YOON D H，et al.Identification of genetic polymorphisms in FABP3 and FABP4 and putative association with back fat thickness in Korean native cattle［J］.BMB Rep，2008，41（1）：29-34.

［23］ SERAO N V，VEROMEZE R，RIBEIRO A M，et al.Candidate gene expression and intramuscular fat content in pigs［J］.J Anim Breed Genet，2011，128（1）：28-34.

［24］ ZHOU L，JIN J，SONG G，et al.α-Lipoic acid ameliorates mitochondrial impairment and reverses apoptosis in FABP3-overexp ressing embryonic cancer cells［J］.J Bioenerg Biomembr，2013，45（5）：459-466.