檢測胸膜肺炎放線桿菌7型抗體的競爭ELISA方法的建立與應用

李樹清，陳志飛，張 強，吳建祥，劉雨瀟，王巧全，林穎崢，宋 青，唐智芳，陸承平

(1.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135；2.浙江大學，杭州 310058； 3.上海交通大學農業(yè)與生物學院，上海 200240；4.南京農業(yè)大學，南京 210095)

檢測胸膜肺炎放線桿菌7型抗體的競爭ELISA方法的建立與應用

李樹清1，陳志飛1，張 強1，吳建祥2，劉雨瀟3，王巧全1，林穎崢1，宋 青1，唐智芳1，陸承平4*

(1.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135；2.浙江大學，杭州 310058； 3.上海交通大學農業(yè)與生物學院，上海 200240；4.南京農業(yè)大學，南京 210095)

針對豬傳染性胸膜肺炎(App)最主要的流行血清型7型，建立該型特異的抗體檢測方法，并應用于出入境檢疫。使用App 7型參考菌株制備單克隆抗體，基于辣根過氧化物酶標記的單抗，建立檢測App 7型抗體的競爭ELISA方法，用于檢測出入境臨床采集及免疫接種的豬血清樣品，并與商品化進口試劑盒進行比較。結果顯示制備的單抗為IgM，與App 7型參考菌株之外的其他14個血清型以及27株其他相關菌株均無交叉反應。建立的競爭ELISA方法只能檢測App 7型抗體，特異性好。用該方法檢測App 7型參考菌株免疫豬的血清，免疫后14 d可檢出抗體，35 d抗體滴度達峰值，并維持此滴度至143 d。使用建立的競爭ELISA檢測免疫豬及臨床血清樣品260份，結果與法國IDvet試劑盒檢測符合率為97.2%，與加拿大Biovet試劑盒檢測符合率為97.9%～98.2%。建立的競爭ELISA方法可以應用于App 7型抗體的檢測。

胸膜肺炎放線桿菌7型；抗體檢測；競爭ELISA

豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，App)引起豬的一種呼吸道傳染病，具有高度傳染性。該病最急性或急性型發(fā)病率和死亡率都在50%以上，慢性型可導致豬生長緩慢，成為僵豬。該病是集約化豬場常見豬病之一，是我國進口種豬檢疫的豬病之一。我國曾多次從美國、丹麥、英國等進口種豬中檢出豬傳染性胸膜肺炎。

根據(jù)胸膜肺炎放線桿菌可溶性抗原莢膜多糖CPS和脂多糖LPS抗原性的差異，可將其分為15個血清型[1]，所有型都可能致病，但有顯著差異。血清學抗體檢測是最重要的診斷方法之一。由于App在各個國家分布的血清型不同，且各型之間沒有完全的交叉保護，因此，準確診斷感染血清型是預防和控制該病的基礎。App血清7型(S7)是重要的致病性血清型，我國從美國、加拿大進口種豬都要求檢疫此血清型，同時也是我國的流行型。根據(jù)吉林大學雷連成等從我國長春分離的App菌株毒力測定，血清7型對小鼠的致死率達66.5%[2]。

由于App各型之間抗原的相似性，部分型之間有交叉反應，如4與7，3、6與8，1、9與11型之間均有交叉反應。目前還沒有只檢測App S7抗體的商品化試劑。為準確鑒定App S7抗體，作者使用App S7參考菌株制備單克隆抗體，基于純化的腹水單抗，研制了競爭ELISA檢測App S7抗體的方法及試劑，可以準確檢測App S7型抗體。同時，應用于免疫豬及出入境臨床樣品的檢測，并與目前主要的兩種進口商品化試劑盒進行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶標記的抗鼠抗體及四甲基聯(lián)苯胺(TMB)均為Sigma產(chǎn)品；對-硝基苯磷酸鹽(PNPP)購于生工生物工程(上海)股份有限公司；單抗亞型檢測試劑盒(荷蘭HyCult Biotechnology產(chǎn)品)，IDvet檢測App4/7型試劑盒及檢測App1～12型試劑盒(法國IDvet公司產(chǎn)品)；Biovet檢測 App4/5/7型試劑盒(加拿大Biovet公司產(chǎn)品)；蛋白保護劑、穩(wěn)定劑購于上海西寶生物技術有限公司。

1.1.2 菌株 試驗中用于檢測單抗特異性的App1～15型參考菌株及其他27株相關菌株來源見表1。

1.1.3 對照血清 試驗中用于檢測競爭ELISA特異性的血清由上海出入境檢驗檢疫局制備或收集保存。包括App豬陰性對照血清，App 1～12型豬高免血清，豬乙型腦炎、豬藍耳病、豬偽狂犬、豬戊型肝炎、豬布氏桿菌病、豬O型口蹄疫、豬副豬嗜血桿菌病、豬支原體病、豬弓形蟲病陽性血清，App 4型、7型兔高免血清以及林氏放線桿菌兔高免血清。

1.1.4 免疫豬不同時期的血清 免疫豬不同時期血清由上海交通大學農業(yè)與生物學院制備。使用App S7參考菌株免疫兩頭豬(1號，2號)，免疫前用IDvet試劑盒檢測App1～12型血清抗體，以及李樹清等[3]建立的核酸檢測方法檢測鼻拭子，抗體和核酸均為陰性。免疫前及免疫后至56 d，每周采血一次，以后第134和143天采血。

1.1.5 臨床血清樣品 2009年至2014年采自丹麥、加拿大、美國進口豬，上海供港豬及上海檢驗檢疫局保存的臨床樣品260份，詳見表2。

1.2 方法

1.2.1 單抗的制備及特異性檢測 巧克力培養(yǎng)基培養(yǎng)App S7參考菌株(WF83)，甲醛滅活后作為免疫抗原；參考吳建祥等[4-5]的方法進行免疫、融合和篩選。陽性雜交瘤細胞用于生產(chǎn)小鼠腹水單抗，按照荷蘭HyCult Biotechnology生產(chǎn)的小鼠單克隆抗體檢測試劑盒說明書[6]進行單抗亞型鑒定。

使用間接ELISA鑒定單抗特異性?？乖?序號見表1)包括App1～15型參考菌株，及其他27株相關菌株。

表1 胸膜肺炎放線桿菌和相關細菌菌株

Table 1 App and reference strains used in test

序號No．種名Name菌株Strain血清型Serotype來源Origin1A．pleuropneumoniae40741丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute2A．pleuropneumoniae15362丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute3A．pleuropneumoniae14213丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute4A．pleuropneumoniaeM624丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute5A．pleuropneumoniaeK175A丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute6A．pleuropneumoniaeL205B丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute7A．pleuropneumoniaeFem?6丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute8A．pleuropneumoniaeWF837丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute9A．pleuropneumoniae4058丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute10A．pleuropneumoniae132619丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute11A．pleuropneumoniae1303910丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute12A．pleuropneumoniae5615311丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute13A．pleuropneumoniae832912丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute14A．pleuropneumoniaeN27313丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute15A．pleuropneumoniae390614丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute16A．pleuropneumoniaeHS14315丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute17A．lignieresiiP670丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute18A．lignieresiiP155丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute19A．lignieresiiP671丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute20A．lignieresiiATCC49236(NCTC4189)丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute21A．rossiiATCC27072丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute22A．suisCAPM(CCM)5586丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute23A．equuliNCTC8529丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute24Mannheimia(Pasteurella)haemolyticaNCTC9380丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute25PasteurellaaerogenesATCC27883丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute26PasteurellamultocidaCCUG17976B丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute27BordetellabronchisepticaCCUG219丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute28StreptococcussuisNCTC10234丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute29TrueperellapyogenesCCUG13230丹麥獸醫(yī)研究所DanishVeterinaryInstitute30Bordetellabronchiseptica波2獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)31Bordetellabronchiseptica波052獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)

(轉下頁 Carried forward)

1.2.2 單抗的純化及效價測定 將腹水單抗參考杜平方法[7]用硫酸銨純化。參考韓文瑜等的方法[8]，用改良過碘酸鈉法將純化的單抗與HRP偶聯(lián)，即得到HRP標記的單抗。

采用直接ELISA法測定酶標抗體效價，以App S6抗原為陰性對照。

1.2.3 競爭ELISA檢測AppS7抗體

1.2.3.1 抗原和樣品血清的最佳工作濃度的測定：參考杜軍等[9]的方法制備多糖抗原，將抗原1∶200至1∶6 400稀釋，使用1.2.2中滴定的酶標單抗，競爭ELISA檢測陽性、陰性豬血清及空白對照(用稀釋液代替血清)。選擇陰性對照血清競爭較少，且吸光值在1.0左右的抗原濃度作為抗原工作濃度。

將App S7豬高免血清、兔高免血清以及豬陰性血清和兔陰性血清分別按照1∶4至1∶512倍比稀釋，使用以上確定的抗原及酶標抗體的濃度，用競爭ELISA檢測，同時設立空白對照，選擇陰性血清競爭結合較少時的最低血清稀釋度為血清最佳稀釋濃度。

1.2.3.2 競爭ELISA陰性和陽性臨界值(Cutoff值)的確定：參考OIE推薦的方法[10]，使用已知陽性和已知陰性血清確定Cutoff值。用于確定Cutoff值的血清235份，其中用于確定Cutoff值的陽性32份，為App S7標準菌株免疫豬或臨床檢疫陽性，均用兩種商品化試劑盒確定為陽性的豬血清。用于確定Cutoff值陰性的血清203份，分別來自加拿大90份、法國22份、丹麥55份進口種豬及上海供港豬場36份，均經(jīng)過兩種商品化試劑盒檢測確定為陰性的豬血清。血清按照1.2.3.1中確定的最佳稀釋濃度稀釋，用競爭ELISA檢測。計算陽性、陰性血清分別與陰性對照血清吸光值的百分比，根據(jù)其比值作散點圖，根據(jù)散點圖確定Cutoff值。

1.2.4 競爭ELISA的特異性 使用確定的競爭ELISA程序檢測1.1.3中的對照血清，以判定該方法的特異性。

1.2.5 競爭ELISA試劑的穩(wěn)定性和重復性 抗原包被過夜，用含保護劑的封閉液封板，抽真空。陽性和陰性血清加入防腐劑，均4 ℃保存。酶標抗體用穩(wěn)定劑按照1∶100稀釋，37 ℃保存。按照競爭ELISA檢測程序，在16 d內檢測7次陰性、陽性血清，按照酶儲存37 ℃ 1 d相當于儲存2～8 ℃ 1.5個月計算，檢測試劑的穩(wěn)定性。

對4份已知血清重復檢測7次，比較檢測結果的重復性。

1.2.6 競爭ELISA揭示免疫豬血清抗體消長規(guī)律 用競爭ELISA檢測2號免疫豬不同時期采集的血清，分析其抗體消長規(guī)律。

1.2.7 競爭ELISA與商品化檢測試劑盒比較 用競爭ELISA分別檢測兩頭免疫豬不同時期采集的血清、臨床血清樣品，同時用加拿大Biovet公司[11]和法國IDvet公司[12]的間接ELISA試劑盒檢測，并計算競爭ELISA與進口商品化檢測試劑盒的符合率。

2 結 果

2.1 單抗特性

獲得的單抗經(jīng)小鼠單抗亞型檢測試劑盒檢測為IgM亞型。

使用間接ELISA鑒定單抗特異性，該單抗僅可特異性地與App S7抗原反應，不能與App其他14個血清型的抗原以及其他27株相關菌株抗原反應。以App S7為抗原，酶標單抗的最佳工作濃度為1∶20 000。

2.2 競爭ELISA檢測App S7抗體試劑盒的研制

2.2.1 抗原及血清最佳工作濃度 競爭ELISA的程序：包被抗原，加入被檢的血清及HRP標記的單抗，然后顯色測定吸光值(OD450 nm)。當抗原為1∶800以下稀釋度時，陰性血清與空白對照吸光度比值均在95%以上，且陽性血清與陰性血清吸光度的差異最大，見圖1。因此，選用抗原1∶800為最佳工作濃度。血清1∶16稀釋時，陰性血清競爭結合不明顯，因此血清1∶16為被檢血清的最佳稀釋濃度。

2.2.2 競爭ELISA檢測結果判定 陽性血清與陰性對照吸光值百分比的散點圖見圖2，陰性血清與陰性對照吸光值百分比的散點圖見圖3。通過散點分布圖分析陽性血清比值絕大部分在20%以下 (僅1份血清比值在20%以上，概率為3.13%)，故設置陽性比值為小于或者等于20%為陽性臨界值。而大部分陰性血清比值均在40%以上(僅3份陰性血清在40%以下，其概率為1.48%)，故設置陰性比值大于40%時為陰性臨界值，介于兩者間的為可疑。

圖1 不同抗原稀釋度檢測血清的吸光值Fig.1 The absorbance of sera and control at different dilution of antigen

圖2 陽性血清比值的散點圖Fig.2 The scatter diagram of the ratio of positive sera with negative control

圖3 陰性血清比值的散點圖Fig.3 The scatter diagram of the ratio of negative sera with negative control

結果計算及判定：計算陽性、陰性對照平均OD值，及樣品與陰性對照的比值(S/N)。陰性對照血清OD值應大于0.8；陽性對照與陰性對照的OD比值應小于或等于20%；對照成立才能進行樣品判斷；1∶16稀釋的血清樣品，其S/N值≤20%為陽性，S/N>40%為陰性，40%≥S/N>20%為可疑。

2.3 競爭ELISA的特異性

建立的競爭ELISA可特異檢測App 7型豬血清和兔血清，與其他血清無交叉，特異性為100%。

2.4 競爭ELISA的穩(wěn)定性和重復性

競爭ELISA檢測，在16 d內陰性、陽性血清變化見圖4。結果顯示，酶標抗體保存于37 ℃第7天，陰性血清OD值沒有明顯的變化，第9天OD值顯著下降至0.8以下，但到第16天陽性與陰性的比值仍然低于20%，陽性對照仍然成立。按照7 d計算，該試劑在4 ℃保質期最少10個月。

按照競爭ELISA檢測程序，對4份血清重復檢測7次，結果完全一致，與預期結果相符。

圖4 不同時間陰性和陽性血清吸光值的變化Fig.4 The change of the absorbance of positive and negative serum at different time

2.5 免疫豬血清抗體消長規(guī)律

根據(jù)競爭ELISA對2號免疫豬血清效價的測定：免疫14 d后血清1∶128稀釋為陽性，經(jīng)過多次免疫，35 d后效價上升，血清1∶1 024稀釋仍為陽性，143 d后抗體效價仍然維持在這個水平。

2.6 競爭ELISA與商品化檢測試劑盒比較

2.6.1 檢測免疫豬 用IDvet試劑盒和Biovet試劑盒檢測兩頭免疫豬不同時期采集的血清，與競爭ELISA檢測結果比較。三種試劑檢測2號豬的結果完全相符。Biovet試劑盒檢測1號豬，有一份樣品不同，其余均相符。

2.6.2 檢測臨床樣品 競爭ELISA檢測260份臨床樣品，與IDvet試劑盒及Biovet試劑盒比較，結果有8份不相符，其余均相吻合，具體見表2。

2.6.3 競爭ELISA與其他商品化檢測試劑盒的相符率 將2.6.1和2.6.2檢測的結果(見表3)進行比較。如果將可疑算作陽性，則競爭ELISA與IDvet的相符率為97.2%[(281-8)/281]，與Biovet的相符率為98.2%[(281-5)/281]；如果將可疑算作陰性，則競爭ELISA與Biovet的相符率為97.9%[(281-6)/281]。說明作者建立的競爭ELISA試劑盒與商品化檢測試劑盒有很好的相符性，可用于臨床樣品的檢測。

3 討 論

3.1 單抗亞型

單抗篩選中，得到3株針對App S7型單抗，本文選擇了其中一株反應強的單抗進行試驗，該單抗經(jīng)亞型鑒定為IgM。加拿大A.Lebrun[13]報道的App S7單抗也為IgM，可能與App的全菌免疫原主要為多糖(CPS和LPS)抗原有關。

3.2 競爭ELISA的優(yōu)勢

目前國內還沒有特異檢測App 7型的商品化試劑盒，因為7型與4型有部分相似的表面抗原，會出現(xiàn)交叉反應。為準確檢測App7型，作者從App15個血清型中篩選到僅針對7型的單抗，在此基礎上，研制了競爭ELISA檢測App7型抗體的方法和試劑，對App的診斷和免疫防控有重要意義。另外，與間接ELISA相比，競爭ELISA檢測無種屬特異型，除檢測豬抗體外，還能檢測鼠等實驗動物抗體，可以用于豬傳染性胸膜肺炎實驗動物模型效果評估。且競爭ELISA方法檢測樣品可以在1 h內完成，比目前的商品化間接ELISA檢測試劑盒快0.5 h，比檢驗檢疫行業(yè)標準[14]使用的阻斷ELISA快1.5 h，1 d內可以完成多批次樣品檢測，符合疫病快速診斷的要求。

3.3 競爭ELISA與其他試劑盒的比較

國內外可檢測App S7的商品化試劑盒主要有：加拿大Biovet公司生產(chǎn)的以長鏈脂多糖LPS為檢測抗原的間接ELISA試劑盒[11]，可同時檢測App4/5/7型；法國IDvet公司生產(chǎn)的以長鏈脂多糖LPS為檢測抗原的間接ELISA試劑盒[12]，可同時檢測App4/7型；美國IDEXX[15]及華中農大[16]生產(chǎn)的間接ELISA試劑盒，使用重組毒素蛋白ApxⅣ為檢測抗原，可以檢測全部血清型App，且能區(qū)別活菌感染和滅活菌免疫；法國LSI[17]生產(chǎn)的間接ELISA試劑盒，使用毒素蛋白ApxⅠ及表面轉鐵結合蛋白Tbp2作為檢測抗原，可檢測所有血清型的App。根據(jù)國外對商品化試劑盒的比較[18]，以長鏈脂多糖LPS為檢測抗原的間接ELISA檢測實驗感染豬的敏感性和特異性最好。作者建立的競爭ELISA方法與這類試劑盒比較，符合率達到97%以上，說明建立的競爭ELISA方法可用于臨床樣品的檢測。由于此前沒有能準確鑒定S7型抗體的試劑，在確定本方法的敏感性時只能使用標準菌株制備的陽性血清32份，數(shù)量較少，因而還需要將研制的競爭ELISA試劑盒在臨床上更多的應用與驗證。

表2 三種試劑盒檢測臨床樣品結果

Table 2 The results of clinical samples detected by three types of kits

樣品SamplecELISAIDvetBiovet陽性Positive陰性Negative可疑Suspicious陽性Positive陰性Negative陽性Positive陰性Negative可疑Suspicious丹麥豬血清55份55serumfrompigsimportedfromDanmark05500550550法國豬血清32份32serumfrompigsimportedfromFrance03200320320加拿大豬血清112份112serumfrompigsimportedfromCanada21073211021100美國豬血清20份20serumfrompigsimportedfromAmerica02000200200上海供港豬血清40份40serumfrompigslocatedinShanghaifarm04004360400本單位保留血清1份1serumstoredatSHCIQ01010001共計260份Total26022553725322571

表3 三種試劑盒檢測結果比較

Table 3 The comparison of results detected by three types of kits

樣品SamplecELISAIDvetBiovet陽性Positive陰性Negative可疑Suspicious陽性Positive陰性Negative陽性Positive陰性Negative可疑Suspicious臨床樣品260份260samples22553725322571免疫2號豬11份11samplescollectedfromNo．2immunizedswine92092920免疫1號豬10份10samplescollectedfromNo．1immunizedswine72182532共計281份Total28118259424257162623

4 結 論

在制備胸膜肺炎放線桿菌(App)7型單抗的基礎上，研制了競爭ELISA方法及相應的試劑，可以特異地檢測App 7型抗體，與國外商品化檢測試劑盒有很高的符合率，可應用于臨床樣品的檢測。

致謝 上海交通大學農業(yè)與生物學院孫建和教授，嚴亞賢教授，中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所魏建超博士在文章的撰寫上給予了無私的幫助，在此表示感謝。

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(編輯 白永平)

Development and Application of Competitive ELISA for Detecting Antibody againstActinobacilluspleuropneumoniaeSerotype 7

LI Shu-qing1，CHEN Zhi-fei1，ZHANG Qiang1，WU Jian-xiang2，LIU Yu-xiao3，WANG Qiao-quan1， LIN Ying-zheng1，SONG Qing1，TANG Zhi-fang1，LU Cheng-ping4*

(1.ShanghaiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureauofthePeople′sRepublicofChina，Shanghai200135，China；2.ZhejiangUniversity，Hangzhou310058，China； 3.SchoolofAgricultureandBiology，ShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai200240，China； 4.NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China)

The study was conducted to develop the specific method for detecting antibody againstActinobacilluspleuropneumoniae(App) serotype 7(S7)，the most prevalent serotype all over the world，and apply to the inspection and quarantine for antibodies of imported and exported pigs.Hybridoma cell line secreting monoclonal antibody(McAb) against App S7 was screened，and the McAb was purified from mouse ascitic fluid and labeled with HRP.The competitive ELISA(cELISA)was developed and its specificity and stability were tested.The sera collected from pigs immunized with reference strain of App S7 or field samples were assayed by this cELISA and other commercial ELISA kits parallelly.The McAb，characterized as IgM，can react specifically with reference strain of App S7，and no cross-reaction with other serotype strains and 27 other strains.The developed cELISA was also specific for detecting antibody against App S7.The antibody against App S7 from the immunized pig can be detected by this method at 14 days post injection，the antibody titer reached and kept at the peak from 35 to 143 days post immunization.The data detected from the samples of 260 clinical sera and the immunized swines，showed that the cELISA have 97.2% coincidence with IDvet test kit and 97.9%-98.2% consistent with Biovet test kit.This cELISA can be used to detect antibody againstActinobacilluspleuropneumoniaeserotype 7 with high specificity.

Actinobacilluspleuropneumoniaeserotype 7；antibody detection；competitive ELISA

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.10.016

2015-01-26

上海出入境檢驗檢疫局科研專項(HK004-2008)

李樹清(1964-)，女，四川眉山人，研究員，碩士，從事進出口動物檢疫工作，Tel：021-38620591, E-mail：lisq@shciq.gov.cn

*通信作者：陸承平， E-mail: lucp@njau.edu.cn

S852.619

A

0366-6964(2015)10-1829-09