轉(zhuǎn)錄因子USF1調(diào)控雞小腸上皮細胞中糖類轉(zhuǎn)運蛋白表達

張利環(huán)，李玲香，張 瑜，原一桐，王文魁，朱芷葳，王欽德，李慧鋒＊

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷030801）

糖類是動物體內(nèi)不可或缺的營養(yǎng)物質(zhì)，具有提供能量、構(gòu)成細胞骨架、物質(zhì)代謝的碳骨架等生物學(xué)功能，只有在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為葡萄糖、果糖、半乳糖等基本的單糖后才可以被腸道上皮細胞所吸收利用。在細胞膜內(nèi)外，單糖跨膜轉(zhuǎn)運的實現(xiàn)主要由糖類營養(yǎng)轉(zhuǎn)運蛋白來完成［1-2］。其中，葡萄糖轉(zhuǎn)運體（Glucose transporter，GLUT）是一類調(diào)控細胞外葡萄糖進入細胞內(nèi)的跨膜蛋白家族，參與糖代謝、炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答等過程［3］。鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白（Sodiumdependent glucose transporter，SGLTs）是一類位于小腸黏膜和腎近曲小管細胞中的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族，其中鈉離子依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白SGLT1在小腸葡萄糖的吸收中發(fā)揮重要作用［4-5］。糖類營養(yǎng)轉(zhuǎn)運蛋白基因何時表達、腸道不同部位的表達特點以及表達量等都要受到多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的調(diào)控［6］。

上游刺激因子（Upstream stimulatory factor，USF）屬于進化高度保守性堿性-螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈（Basic helix-loop-helix，b HLH）蛋白家族成員，主要包括USF1和USF2兩種，能結(jié)合靶基因DNA上的E-box位點而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。其中，USF1可作用于多種靶基因，在糖脂代謝、細胞增殖、刺激前列腺素合成和黑素沉積等過程中發(fā)揮重要作用［7-9］。有研究表明，在肝中單糖轉(zhuǎn)運蛋白基因和肝丙酮酸激酶（L-PK）mRNA表達量隨葡萄糖濃度升高而增高，這些基因的5′調(diào)控區(qū)都存在著葡萄糖應(yīng)答元件（Glucose response element，GLRE），USF蛋白形成復(fù)合體結(jié)合到葡萄糖應(yīng)答元件上，增強L-PK基因的表達［10］。GLUT 2基因同樣受到葡萄糖濃度的影響，其表達量變化與L-PK 基因相似［11］，但其受USF1調(diào)控的機制卻沒有L-PK基因研究的詳細。

本研究通過構(gòu)建USF 1真核表達載體，在雞小腸上皮細胞中過表達USF 1，利用實時熒光定量PCR檢測糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT2、GLUT5和SGLT1的表達變化，分析轉(zhuǎn)錄因子USF1在小腸上皮細胞中對單糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達影響。研究結(jié)果不僅對研究雞腸道營養(yǎng)吸收的分子調(diào)控機理有重要的理論意義，而且可以為以提高飼料轉(zhuǎn)化率為目的的選育實踐提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本研究以山西康牧禽業(yè)提供的海蘭褐蛋雞15日齡雞胚若干作為腸道上皮細胞原代培養(yǎng)的細胞來源。

1.2 主要試劑藥品

Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko購自日本Sigma公司；Recombinant Mouse EGF購自美國加州Bio Legend公司；Mouse Anti-Cytokeratin 18 Monoclonal Antibody購自美國Millipore公司；濃縮型DAB試劑盒、免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司；Lipofectamine 2000 Reagent、Trizol Reagent購自美國Invitrogen生物技術(shù)公司；SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit（Perfect Real Time）、第一條鏈合成試劑盒、T載體、pcDNA3.1載體、rTaq酶、限制性內(nèi)切酶Eco R I、Xho I、T4連接酶、DL2000 Marker等購自大連TaKaRa公司；其他常規(guī)生化試劑均為試驗級分析純。

1.3 洗液的配制

1號洗液：38.0 m L PBS中加入青鏈霉素混合液2.0 m L，使雙抗最終含量為5%；2號洗液：38.8 m L PBS中加入青鏈霉素混合液1.2 m L，使雙抗最終含量為3%；3號洗液：39.6 m L PBS中加入青鏈霉素混合液0.4 m L，使雙抗最終含量為1%。

1.4 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中雞及相關(guān)禽類USF 1、SGLT 1、GLUT 2和GLUT 5（GenBank登錄號分別為NM＿001007485.1、XM＿415247、NM＿207178和XM＿004947448）的基因信息，進行同源性比對，利用Primer5.0軟件設(shè)計引物。引物信息見表1，在USF 1基因編碼區(qū)的克隆引物中添加Eco R I與Xho I限制性內(nèi)切酶位點。

1.5 真核表達載體的構(gòu)建

以雞小腸cDNA為模板，擴增USF 1基因的CDS區(qū)，擴增片段經(jīng)純化后，采用Eco R I與Xho I雙酶切，與pcDNA3.1載體進行連接，用酶切法和測序法對重組質(zhì)粒進行鑒定。

1.6 雞IEC體外分離培養(yǎng)及鑒定

1.6.1 雞IEC體外分離培養(yǎng) 取15日齡雞胚，分離小腸，去除腸系膜，于超凈臺清洗多次，剪成1 mm3的組織塊，放入盛有2倍體積50μg·m L-1嗜熱菌蛋白酶HEPES消化液，37℃80 r·min-1振蕩消化120 min。用PBS稀釋酶消化液，反復(fù)多次稀釋吹打至懸浮液清亮，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。采用相差貼壁法接種，細胞密度約為6.5×105個·m L-1，于40℃7%CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，按時觀察細胞貼壁生長狀態(tài)。

表1 PCR引物Table 1 PCR primers

1.6.2 雞小腸上皮細胞鑒定 通過形態(tài)學(xué)觀察、細胞生長計數(shù)等方法初步鑒定原代IEC細胞。細胞角蛋白18（Cytokeratin 18，CK18）是上皮組織特異性的抗原成分，采用免疫組化法檢測CK18在細胞中的表達。

1.7 轉(zhuǎn)染雞小腸上皮細胞

體外分離培養(yǎng)的IEC培養(yǎng)至第6天時，從中挑選生長狀態(tài)良好、長勢大致相同的9孔細胞換完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)12 h后用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-USF1，設(shè)置空載體組和不轉(zhuǎn)染組作為對照，在每組中設(shè)立6個重復(fù)，于40℃7% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48 h后，觀察細胞形態(tài)學(xué)變化，收集細胞及上清。

收集細胞于1.5 m L RNaseFree的離心管中，采用Trizol裂解法提取總RNA，紫外分光光度法測量濃度及純度，用1%甲醛變性凝膠電泳檢測。按照Ta KaRa反轉(zhuǎn)錄說明書合成cDNA第一條鏈，-20℃保存。

1.8 檢測USF 1、SGLT1、GLUT2和GLUT5基因的表達量

依據(jù)Ta KaRa公司2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ定量試劑盒，篩選各引物的最佳體系和反應(yīng)條件，建立了USF 1、SGLT1、GLUT2和GLUT5基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測USF 1、SGLT1、GLUT2和GLUT 5基因的表達量，獲得各樣本c DNA相應(yīng)基因的表達拷貝數(shù)。

1.9 統(tǒng)計分析

應(yīng)用SAS 8.1統(tǒng)計軟件進行方差分析，采用Duncans法進行多重比較，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 USF 1基因CDS區(qū)片段的擴增

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳30 min后，結(jié)果顯示，PCR擴增產(chǎn)物條帶清晰，前后無非特異性條帶出現(xiàn)，約952 bp，與預(yù)計相符（圖1）。

圖1 USF 1基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR products of USF 1 gene

2.2 pcDNA3.1-USF1重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果

重組載體pcDNA3.1-USF1經(jīng)過限制性內(nèi)切酶Eco R I和Xho I進行雙酶切，1%的瓊脂糖凝膠電泳后，可清晰看到酶切出的兩個條帶，與預(yù)期的條帶相符。這表明已成功構(gòu)建了真核表達載體pcDNA3.1-USF1，其全長6 368 bp，USF 1插入位點為958～1 898 bp，如圖2。構(gòu)建的真核表達載體經(jīng)過測序分析，結(jié)果顯示所測序列與對應(yīng)已知序列相符。

圖2 pcDNA3.1-USF1酶切產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of plasmid pcDNA3.1-USF1 endonuclease digestion

2.3 雞IEC形態(tài)學(xué)鑒定

純化獲得的IEC在40℃7%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 d后貼壁生長，并呈島嶼狀分布，之后IEC逐漸向四周漂移蔓延，在7、8 d時進入對數(shù)生長期，IEC匯合成片呈“鋪路石狀”分布，多為多角形、卵圓形和圓形（圖3），生長時IEC呈膜狀移動，成片生長，很少單個細胞單獨貼壁生長。

2.4 細胞生長曲線

通過計數(shù)法測定細胞生長曲線，細胞生長曲線呈“S”型（圖4），有一段約48 h的潛伏期或緩慢生長期，此后，細胞進入指數(shù)生長期或?qū)?shù)生長期，在指數(shù)生長期，細胞的倍增時間為60～96 h，培養(yǎng)后期細胞生長率下降，由于產(chǎn)生接觸抑制和密度抑制，細胞生長緩慢或停止生長，有些細胞甚至死亡。

圖3 IEC形態(tài)學(xué)鑒定圖Fig.3 The morphological identification of IEC

圖4 雞小腸上皮細胞原代培養(yǎng)生長曲線Fig.4 Growth curve of chicken intestinal epithelial cells

2.5 雞IEC免疫組化鑒定

CK18是上皮組織中特異性的抗原蛋白，對雞IEC進行免疫組化鑒定時，在試驗組中滴加鼠抗雞CK18單克隆抗體，在對照組中選用PBS代替一抗。光學(xué)倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)（圖5），試驗組細胞漿呈棕黃色為陽性，而對照組細胞漿未著色。

2.6 雞IEC轉(zhuǎn)染后形態(tài)學(xué)觀察

細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染48 h后在倒置顯微鏡下觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、陰性對照組和空白對照組細胞生長狀態(tài)，如圖6?？瞻讓φ战M中，細胞之間緊密相連呈“鋪路石狀”分布，多為多角形、卵圓形和圓形，細胞明亮且邊界清晰；而經(jīng)添加Lipofectamine 2000的轉(zhuǎn)染組和陰性對照組，IEC形態(tài)發(fā)生明顯的變化，IEC變暗形態(tài)不規(guī)則、邊界不明顯且細胞之間間隙加大失去原有的IEC形態(tài)特點。

2.7 各基因定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及熔解曲線

本研究中4條基因檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線，各R2均大于0.98，擴增效率在92%～100%，標(biāo)準(zhǔn)曲線均符合條件（圖7）。

USF 1、SGLT1、GLUT2和GLUT5基因的熔解曲線如圖8所示，可以觀察到每條熔解曲線只有單一峰，說明PCR擴增產(chǎn)物的特異性很好。

圖8 雞小腸基因USF 1、GLUT2、GLUT5和SGLT1熔解曲線Fig.8 The melting curves of USF 1，GLUT2，GLUT5 and SGLT1 in chicken small intestine

2.8 USF 1、SGLT1、GLUT2和GLUT5基因表達量的測定

表2為基因表達分析結(jié)果，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組USF 1 mRNA表達量較空白對照組、陰性對照組極顯著增高（P＜0.01）。其中，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組USF 1 mRNA表達量分別是空白對照組和陰性對照組的2.83和2.35倍。

表2 不同轉(zhuǎn)染組內(nèi)各基因絕對表達量Table 2 Absolute expression of genes in different transfection groups

重組質(zhì)粒pcDNA3.1-USF1成功轉(zhuǎn)染IEC后，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組GLUT 2 m RNA表達量較空白對照組和陰性對照組極顯著增高（P＜0.01）。其中，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組GLUT 2 mRNA表達量分別是空白對照組和陰性對照組的1.92和1.58倍；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組GLUT 5 mRNA表達量與空白對照組、陰性對照組間差異不顯著（P＞0.05）；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SGLT1 mRNA表達量較空白對照組和陰性對照組極顯著增高（P＜0.01）。其中，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SGLT1 mRNA表達量分別是空白對照組和陰性對照組的1.54和1.30倍。

3 討 論

3.1 影響細胞轉(zhuǎn)染效率因素的探討

陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)染方法具有轉(zhuǎn)染效率高，可重復(fù)性強等特點，因而被廣泛應(yīng)用。轉(zhuǎn)染效率的高低主要與細胞接種密度、細胞的傳代次數(shù)、脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA的比例、血清的含量等因素有關(guān)。本試驗所使用的轉(zhuǎn)染試劑是脂質(zhì)體Lipofectamine2000。為了避免出現(xiàn)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時對細胞毒性大，引起部分細胞死亡的情況，進行試驗時適當(dāng)減少了重組質(zhì)粒DNA的用量，在雞IEC細胞的匯合度達到80%～90%時進行試驗，并設(shè)計脂質(zhì)體用量，篩選出最佳比例。最終確定質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)體的比例為1∶2時轉(zhuǎn)染效果最好。

3.2 雞IEC體外分離培養(yǎng)

近年來，體外分離培養(yǎng)IEC被作為研究探討腸道的生物學(xué)功能、營養(yǎng)物質(zhì)在腸道中吸收及調(diào)控機制的主要手段。雞ICE體外分離培養(yǎng)不僅對研究雞腸上皮細胞增殖、分化以及凋亡規(guī)律提供了理論依據(jù)，而且為研究營養(yǎng)素與外界因素對腸上皮的作用機制提供了理想的體外模型［12-13］。

獲得高純度的上皮細胞是本研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。賈國東等在試驗中選用20日齡的雞胚，對腸組織分離后，采用刮取法得到腸絨毛及隱窩單位，然后在體外與成纖維細胞共同培養(yǎng)獲得了活性較高的腸上皮細胞［14］。古少鵬等將消化后的雞盲腸上皮細胞種植到含10%血清的細胞培養(yǎng)液中，1.5 h后把培養(yǎng)液連同未貼壁的細胞轉(zhuǎn)移到離心管中離心5 min，細胞沉淀重新加入含2.5%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液懸浮，后接種于培養(yǎng)板中可以獲得較高純度盲腸上皮細胞［15］。本試驗在前人研究基礎(chǔ)上，將消化分離得到的IEC接種到含10%雞血清的細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)70 min后，收集未貼壁的細胞于含2.5%雞血清的細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)可以獲得較高純度的雞小腸上皮細胞。

3.3 USF 1基因過表達對SGLT1、GLUT2基因表達量的影響

轉(zhuǎn)錄因子USF最初是作為腺病毒晚期啟動子的反式激活因子而被發(fā)現(xiàn)的［16］，USF1與糖脂吸收機制密切相關(guān)［17-18］。S.Wu等人在小鼠體內(nèi)過表達人類轉(zhuǎn)錄因子USF1后，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)的新陳代謝特征包括肥胖、膽固醇水平、膽固醇LDL／VLDL比值和葡萄糖／胰島素比值等均有顯著變化［19］。C.Weigert等研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄生長因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）啟動子的-1 013～-1 002區(qū)域與葡萄糖響應(yīng)元件有高度的同源性，轉(zhuǎn)錄因子USF在高糖狀態(tài)下正調(diào)控基因TGF-β1啟動子活性［20］。目前，轉(zhuǎn)錄因子USF影響糖轉(zhuǎn)運蛋白表達的相關(guān)研究報道非常少。C.P.Corpe等人研究發(fā)現(xiàn)，GLUT5在組織分布、對小腸中果糖含量的敏感度等方面存在差異性表達，并推測可能與GLUT5基因5′區(qū)域存在尾側(cè)型同源基因（Caudal homeobox gene，Cdx A）、USF和Y染色體性別決定區(qū)（Sex-determining region of Y，SRY）結(jié)合位點有關(guān)［21］。J.Barrenetxe等人研究發(fā)現(xiàn)，人上皮細胞系Caco-2細胞質(zhì)膜中GLUT 5和SGLT1基因的表達受TNFα調(diào)控，并進而導(dǎo)致糖轉(zhuǎn)運的改變［22］。在肝細胞中，轉(zhuǎn)錄因子USF形成的復(fù)合體可以結(jié)合在L-PK基因5′調(diào)控序列的葡萄糖應(yīng)答元件上，對L-PK基因的表達產(chǎn)生影響［23］。作為葡萄糖誘導(dǎo)表達的同類基因［24-25］，GLUT2在肝細胞中的表達方式與L-PK基因類似。本研究中，重組質(zhì)粒pc DNA3.1-USF1成功轉(zhuǎn)染IEC后，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組GLUT2和SGLT 1 m RNA表達量均極顯著高于空白對照組和陰性對照組，表明轉(zhuǎn)錄因子USF1過表達對糖轉(zhuǎn)運蛋白基因GLUT 2和SGLT 1起正調(diào)控作用。分析其作用機制可能是USF1蛋白與這兩個基因的上游5′調(diào)控區(qū)的葡萄糖應(yīng)答元件形成復(fù)合體，進而促進它們的表達。

4 結(jié) 論

本研究將USF 1基因真核表達載體轉(zhuǎn)染到小腸上皮細胞，使其過量表達，并測定了相關(guān)糖類轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達量。證明在原代培養(yǎng)的雞小腸上皮細胞中，USF 1基因的過表達在m RNA水平上調(diào)了GLUT2和SGLT1基因的表達。

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