版納微型豬近交系DLDH基因編碼區(qū)序列擴(kuò)增及生物信息學(xué)分析

成文敏，潘偉榮，尹俊芳，黃 言，查星琴，肖 晶，曾養(yǎng)志＊

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明650201；2.昆明市官渡區(qū)人民醫(yī)院，昆明650021；3.云南省版納微型豬近交系重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明650201）

二氫硫辛酰胺脫氫酶（Dihydrolipoamide dehydrogenase，DLDH）是丙酮酸鹽脫氫酶復(fù)合物PDHc、α戊二酸脫氫酶KGDC和支鏈α酮酸脫氫酶BCKDC的組成部分［1-2］，定位于線粒體，屬氧化還原酶類，在真核生物中參與甘氨酸代謝［3］。DLDH具有4個(gè)特色功能域，在線粒體中形成同型二聚體，能夠催化NADH氧化成NAD＋［4］，同時(shí)還原O2、不穩(wěn)定的高價(jià)鐵［5］、一氧化氮［6］和泛醌［7-8］等。除了具有脫氫酶和黃遞酶的活性外，DLDH還具有蛋白酶活性［9］，是一種高度變化的在能量代謝和維持氧化還原態(tài)平衡方面起著多重關(guān)鍵作用的氧化還原酶。同時(shí)DLDH還可參與丙酮酸／乳酸代謝，使用DLDH特異性抑制劑抑制DLDH活性會(huì)發(fā)生乳酸累積，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS、c AMP水平、p H和鈣離子濃度降低［10］。

精子獲能是哺乳動(dòng)物受精過(guò)程中正常受精的必經(jīng)階段，涉及到生物物理學(xué)和生物化學(xué)的轉(zhuǎn)換［11］，包括精子代謝、細(xì)胞內(nèi)p H、c AMP、離子濃度、質(zhì)膜通透性、膜重組及活性氧等［12-14］，其中精子代謝是近年研究的熱點(diǎn)。PDHc和它的亞基DLDH可通過(guò)調(diào)控精子細(xì)胞內(nèi)乳酸、p H和鈣離子濃度影響精子的獲能和頂體反應(yīng)［10，15-16］。K.Mitra等報(bào)道，在精子獲能過(guò)程中DLDH被酪氨酸磷酸化提示了一種新的代謝和信號(hào)傳遞方式［15］，當(dāng)DLDH受抑制時(shí)，c AMP水平也會(huì)明顯降低［17］，c AMP作為DLDH的下游信號(hào)分子，其水平對(duì)倉(cāng)鼠［17］、大鼠［18］和牛［19］精子超活化和頂體反應(yīng)有明顯影響。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于DLDH基因與精子獲能的相關(guān)研究已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，但主要集中在大鼠［18］、倉(cāng)鼠［10-11，15，17］、牛［19］等物種，DLDH基因在版納微型豬近交系的研究仍未見(jiàn)報(bào)道，尤其是DLDH基因與版納微型豬近交系繁殖力的相關(guān)研究仍未開(kāi)展。

版納微型豬近交系（Banna mini-pig inbred line，BMI）是采用全同胞或親子交配的高度近交方式，并進(jìn)行科學(xué)嚴(yán)格的選擇，育成的世界上第一個(gè)大型哺乳動(dòng)物近交系。BMI的培育成功，不僅為生物醫(yī)學(xué)研究提供最佳的試驗(yàn)動(dòng)物，還可為異種移植及基因改造提供最佳供體目標(biāo)豬，為醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)理論和臨床研究帶來(lái)深刻的影響乃至變革［20］。由于BMI在近交過(guò)程中，基因高度純合，導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，使其繁殖能力降低。因此，本研究通過(guò)取自BMI睪丸組織，采用RT-PCR技術(shù)獲得DLDH基因的編碼區(qū)序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在揭示BMI DLDH基因的生物學(xué)特性，為后續(xù)研究精子發(fā)生和精子獲能機(jī)制、提高BMI繁殖力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所使用的組織樣本取自BMI 133家系睪丸組織，經(jīng)液氮處理后置于-80℃冰箱保存。用于RNA提取及反轉(zhuǎn)錄等所涉及的試劑如Trizol裂解液、第一鏈合成試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，2×PCR Premix Taq購(gòu)自寶生物公司（TaKaRa）。RNA提取所用水為經(jīng)DEPC處理的水。

1.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

依產(chǎn)品說(shuō)明，將經(jīng)過(guò)液氮處理置于-80℃冰箱保存的睪丸組織取出，解凍后將組織剪切成小塊，在低溫條件下用研缽研碎組織，用Invitrogen公司的Trizol提取睪丸組織總RNA，使用SuperScriptⅢFirst-Strand Synthesis System進(jìn)行cDNA鏈的合成，建立20μL的反應(yīng)體系，用于逆轉(zhuǎn)錄1 pg～5μg總RNA。將1μL oligo（d T）20（50μmol·L-1）、1 pg～5μg總RNA、1μL 10 mmol·L-1d NTP混合物加DEPC處理的超純水到10μL置于無(wú)核酸酶的微量離心管中，65℃孵育5 min后，迅速置于冰上冷卻至少1 min。短暫離心后，加入以下組分：2μL 10×第一鏈合成緩沖液、2μL 0.1 mol·L-1DTT、4μL 25 mmol·L-1MgCl2、1μL RNase-OUTTM核酸酶抑制劑（40 U·μL-1）、1μL Super-ScriptⅢRT（200 U·μL-1），混合，并在50℃下孵育50 min，85℃孵育5 min以終止反應(yīng)，迅速置于冰上冷卻。加1μL RNase H到離心管中，37℃孵育20 min，獲得的cDNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物

根據(jù)GenBank公布的豬NM＿214062.1序列，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6引物設(shè)計(jì)和分析軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物，擴(kuò)增1 724 bp長(zhǎng)度的DLDH序列（包括編碼區(qū)及部分側(cè)翼序列，位于序列的16～1 739 bp位置）。引物序列：F：5′-GCTTAGCGGAGGTGAAGGAGTT-3′，R：5′-TTCCCTTCTGTCCAAACCTATT-3′。

1.4 PCR反應(yīng)、產(chǎn)物回收及測(cè)序

50μL反應(yīng)體系包括2×Gloden PCR Reaction Mix 25μL，10μmol·L-1的上下游引物各1μL，cDNA模板2μL，H2O 21μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸1 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照，采用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將所得的PCR產(chǎn)物送交公司進(jìn)行直接測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析

將測(cè)序所得的BMI DLDH基因編碼區(qū)序列使用Lasergene軟件初步編輯、比對(duì)，人工校對(duì)，獲得開(kāi)放閱讀框，與GenBank中所公布的與其核苷酸編碼區(qū)序列和相應(yīng)氨基酸序列相似性大的豬、人、小鼠、牛、馬、綿羊、山羊、雞、野鴨、貓、狗、狒狒、猩猩等13個(gè)物種進(jìn)行比對(duì)分析，通過(guò)Bioedit軟件完全比對(duì)，獲得物種DLDH基因以及編碼蛋白之間的變異情況，經(jīng)Edit Plus軟件編輯輸出結(jié)果，通過(guò)MEGA4.0軟件采用鄰接法（Neighbors-jointing，NJ）和最小進(jìn)化法（Minimum-evolution，ME）重建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。系統(tǒng)樹(shù)中節(jié)點(diǎn)的自舉置信水平采用Bootstrap估計(jì)，NJ法和ME法都采用了1 000次循環(huán)。利用ExPasy（http：／／www.expasy.org／tools）中的Protparam推測(cè)序列的氨基酸組成、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、穩(wěn)定性和總親水性等；磷酸化位點(diǎn)采用NetPhos 2.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／NetPhos／）預(yù)測(cè)；Net OGlyc 3.1（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／Net OGlyc／）預(yù)測(cè)糖基化位點(diǎn)；SignalP3.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）預(yù)測(cè)信號(hào)肽；跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)利用TMHMM（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM／）；SOPMA（https：／／npsa-prabi.ibcp.fr／cgi-bin／npsa＿automat.pl？page＝／NPSA／npsa＿sopma.html）參與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；SWISS（http：／／swissmodel.expasy.org／interactive）參與蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，DLDH基因擴(kuò)增出1 724 bp大小的片段，與預(yù)期結(jié)果相符，擴(kuò)增出的條帶清晰、明亮。

2.2 BMI豬和其他12個(gè)物種DLDH基因編碼區(qū)核苷酸序列和編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列相似性

與GenBank上公布的豬的對(duì)應(yīng)序列（NM＿ 214062.1）進(jìn)行比對(duì)后確定BMI DLDH基因編碼區(qū)序列長(zhǎng)1 530 bp。豬（NM＿214062.1）、人（NM＿000108.4）、小鼠（U73445.1）、牛（NM＿001206170.1）、綿羊（XM＿004007853.1）、山羊（XM＿005679140.1）、馬（NM＿001301150.1）、貓（XM＿003982645.2）、狗（NM＿001003294.1）、猩猩（XM＿002803427.1）、狒狒（XM＿009203661.1）等11個(gè)物種的DLDH編碼區(qū)核苷酸序列長(zhǎng)度均為1 530 bp；雞（NM＿001030727.1）DLDH編碼區(qū)核苷酸序列長(zhǎng)度為1 527 bp，鴨（XM＿005010274.1）DLDH編碼區(qū)核苷酸序列長(zhǎng)度為1 545 bp。

圖1 DLDH基因瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR result of DLDH gene by 2%agarose gel electrophoresis

BMI DLDH基因編碼509個(gè)氨基酸。與上述物種相對(duì)應(yīng)的豬（NP＿999227.1）、人（NP＿000099.2）、小鼠（AAC53170.1）、牛（NP＿001193099.1）、綿羊（XP＿004007902.1）、山羊（XP＿005679197.1）、馬（NP＿001288079.1）、貓（XP＿003982694.1）、狗（NP＿001003294.1）、猩猩（NP＿001126999.1）、狒狒（XP＿009201925.1）等11個(gè)物種的DLDH基因均編碼509個(gè)氨基酸；雞（NP＿001025898.1）DLDH基因編碼508個(gè)氨基酸，鴨（XP＿005010331.1）DLDH基因編碼514個(gè)氨基酸。物種間核苷酸序列與氨基酸序列相似性結(jié)果見(jiàn)表1。

將BMI與GenBank公布的豬核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，BMI在第399位、405位、730位核苷酸處發(fā)生突變，結(jié)果見(jiàn)圖2。

利用NJ法和ME法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。

2.3 BMI豬DLDH基因編碼蛋白質(zhì)的特性分析

表1 BMI與13個(gè)物種間DLDH基因編碼區(qū)核苷酸序列和編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列相似性Table 1 Similarity rates of nucleotide sequences and amino-acid sequences of coding region of DLDH gene between BMI and 13 species %

圖3 NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree by NJ

圖4 ME法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree by ME

2.3.1 DLDH蛋白分子質(zhì)量及等電點(diǎn)預(yù)測(cè) 用 Ex PaSy ProtParam程序預(yù)測(cè)DLDH基因開(kāi)放閱讀框共編碼509個(gè)氨基酸，由20種氨基酸組成，分子量為54.187 2 ku，理論等電點(diǎn)（pI）為7.67；其中甘氨酸占11.2%，丙氨酸占9.8%，纈氨酸占9.2%。DLDH蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為30.21，屬于穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)為93.30，總的親水性平均系數(shù)（Grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.015，具有輕度疏水性。

2.3.2 DLDH蛋白磷酸化及糖基化修飾位點(diǎn)用Net OGly 4.0和Net NGly 1.0進(jìn)行結(jié)果預(yù)測(cè)表明，DLDH蛋白中有兩個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，分別在第28和第128位氨基酸；有兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)分別是：NETL位于第73～第76位氨基酸；NNSH位于第93～第96位氨基酸。Net Phos2.0預(yù)測(cè)表明，DLDH蛋白存在19個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中9個(gè)絲氨酸（Ser）磷酸化位點(diǎn)（A170、A203、A208、A285、A292、A297、A405、A446、A476）、9個(gè)蘇氨酸（Thr）磷酸化位點(diǎn)（A188、A194、A199、A240、A282、A341、A345、A431、A489）、1個(gè)酪氨酸（Tyr）活性位點(diǎn)A97。采用SignalP 4.1對(duì)DLDH蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)表明，DLDH不含有蛋白信號(hào)肽。TMHMM server預(yù)測(cè)未發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)。

2.3.3 DLDH蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 用SOPMA方法預(yù)測(cè)的DLDH蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖5所示，參與α-螺旋的氨基酸有157個(gè)，含量達(dá)到30.84%；有148個(gè)氨基酸參與延伸鏈，占29.08%；55個(gè)氨基酸可能參與β-轉(zhuǎn)角，占10.81%；149個(gè)氨基酸可能參與無(wú)規(guī)則卷曲，占29.27%。將獲得的BMI和GenBank公布的豬DLDH氨基酸序列提交至SWISS-MODEL程序，自動(dòng)搜索同源蛋白作模板，得到DLDH單亞基三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果見(jiàn)圖6、圖7所示。

3 討 論

3.1 豬DLDH基因的保守性

圖5 DLDH二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 Secondary structure of DLDH

圖6 BMI DLDH三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 Tertiary structure of DLDH in BMI

圖7 豬DLDH三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.7 Tertiary structure of DLDH in pig

本研究檢測(cè)了BMI JS133家系睪丸組織DLDH基因的編碼區(qū)序列，結(jié)果表明，所擴(kuò)增的DLDH基因序列中包含由1530 bp堿基組成的完整ORF，編碼509個(gè)氨基酸，ATG和TAA堿基分別為ORF的起始和終止密碼子，表明在目的基因擴(kuò)增和測(cè)序過(guò)程中堿基裝配沒(méi)有產(chǎn)生無(wú)義突變致使氨基酸序列編碼中斷。對(duì)不同物種核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，DLDH基因序列在物種間具有高度相似性，并且所有重要功能性氨基酸都是保守的。

前人的研究結(jié)果表明，DLDH可通過(guò)參與丙酮酸／乳酸代謝，從而影響精子獲能和頂體反應(yīng)［10］，同時(shí)還可通過(guò)影響c AMP水平，參與睪酮的合成通路［17］。說(shuō)明DLDH基因在提高雄性動(dòng)物精子發(fā)生頂體反應(yīng)方面發(fā)揮重要的作用，但目前尚無(wú)DLDH基因與豬精子發(fā)生過(guò)程相關(guān)性的研究報(bào)道。本試驗(yàn)擴(kuò)增了BMI DLDH基因編碼區(qū)序列并進(jìn)行了比對(duì)，結(jié)果表明，BMI 133家系在第399位T→C和405位A→G為同義突變。730位C→T核苷酸發(fā)生錯(cuò)義突變，氨基酸由苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼?，這些多態(tài)性可作為BMI的分子標(biāo)記。

3.2 豬DLDH基因的分類學(xué)地位

從BMI與GenBank中獲得的其他11個(gè)物種的DLDH基因編碼的氨基酸序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)看，BMI豬與普通家豬聚為一類，為偶蹄目豬科動(dòng)物；牛、綿羊、山羊聚為一類，牛、羊均為偶蹄目?？苿?dòng)物；貓為貓科，狗為犬科，均為食肉目動(dòng)物，聚為一類，馬為奇蹄目馬科動(dòng)物，單獨(dú)一類；猩猩為猩猩科，狒狒為猴科，人為人科，均屬靈長(zhǎng)目，聚為一類；小鼠為嚙齒目鼠科，單獨(dú)聚為一類，以上所有物種均為哺乳綱。雞為雞行目雉科，野鴨為雁形目鴨科，均為鳥(niǎo)綱，聚為一類。

3.3 豬DLDH蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，利用軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)已成為發(fā)展趨勢(shì)。本試驗(yàn)中通過(guò)對(duì)DLDH基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，DLDH蛋白中存在著豐富的磷酸化位點(diǎn)，說(shuō)明磷酸化位點(diǎn)修飾對(duì)DLDH的蛋白活化起著重要作用。通過(guò)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，α-螺旋與無(wú)規(guī)則卷曲可能是DLDH蛋白的主要結(jié)構(gòu)，形成的DLDH單亞基三級(jí)結(jié)構(gòu)中包含α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲，最終形成的DLDH蛋白為單亞基組成的同二聚體，其中每個(gè)亞基都與一分子的FAD以共價(jià)鍵的形式相連。BMI與豬蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，由于BMI中399、405位點(diǎn)處發(fā)生同義突變，730位點(diǎn)發(fā)生錯(cuò)義突變，由苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼?，?dǎo)致DLDH三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其功能是否發(fā)生變化仍需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

采用RT-PCR技術(shù)獲得BMI DLDH基因完整的編碼區(qū)序列，其序列全長(zhǎng)1 530 bp，編碼509個(gè)氨基酸，且與其他物種存在較高的相似性。與Gen-Bank公布的豬DLDH序列比對(duì)結(jié)果顯示，BMI 133家系在第399位、405位、730位核苷酸發(fā)生突變，是否導(dǎo)致DLDH蛋白功能發(fā)生改變?nèi)孕柽M(jìn)一步深入研究。BMI DLDH蛋白中有豐富的磷酸化位點(diǎn)，可通過(guò)磷酸化修飾提高DLDH蛋白的活性。本次試驗(yàn)擴(kuò)增的DLDH基因可為進(jìn)一步研究BMI DLDH基因的表達(dá)信號(hào)通路、與精子獲能和頂體反應(yīng)發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控提供必要的基礎(chǔ)。

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