紫外分光光度法測(cè)定醉魚(yú)草果實(shí)中總黃酮含量

肖龍泉，任亞碩，吳德玲，汪天明

(1.安徽省亳州市人民醫(yī)院，安徽 亳州　236804；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥　230038；

3.安徽省現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥　230038)

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紫外分光光度法測(cè)定醉魚(yú)草果實(shí)中總黃酮含量

肖龍泉1，任亞碩2,3，吳德玲2,3，汪天明2,3

(1.安徽省亳州市人民醫(yī)院，安徽 亳州236804；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥230038；

3.安徽省現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥230038)

摘要:目的建立醉魚(yú)草果實(shí)中總黃酮的含量測(cè)定方法。方法采用紫外分光光度法，以蘆丁為對(duì)照品，通過(guò)亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉系統(tǒng)顯色法測(cè)定醉魚(yú)草果實(shí)中總黃酮的含量。結(jié)果蘆丁在8.56~51.36 mg·L-1范圍內(nèi)吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系(A=0.012 0C-0.007 1，r=0.999 8)，平均加樣回收率為98.76%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.74%(n=6)，所測(cè)得醉魚(yú)草果實(shí)中總黃酮含量為5.29%。結(jié)論該方法操作快速、簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于醉魚(yú)草果實(shí)中總黃酮成分的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞:醉魚(yú)草果實(shí)；總黃酮；紫外分光光度法；含量測(cè)定

醉魚(yú)草果實(shí)藥材是馬錢(qián)科植物醉魚(yú)草(BuddlejalindleyanaFort.)的果實(shí)，具有祛風(fēng)除濕、止咳化痰、散瘀之功效[1]。文獻(xiàn)報(bào)道醉魚(yú)草屬植物中含有豐富的化合物種類，包括黃酮類，三萜類及苯乙醇苷類等[2-5]，其中黃酮類成分，具有多種藥理活性[6-7]。經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)，醉魚(yú)草果實(shí)中同樣含有豐富的黃酮類化合物[8]，主要為蘆丁、槲皮素、木犀草素等，是其主要藥理活性成分，其中蘆丁是一種脫氫黃素酮的糖苷，在各類植物中普遍存在，且含量較高。醉魚(yú)草果實(shí)中黃酮類含量的測(cè)定方法未見(jiàn)報(bào)道，為了進(jìn)一步研究醉魚(yú)草果實(shí)中的黃酮類成分，本研究選用蘆丁作為對(duì)照品，通過(guò)經(jīng)典的亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法[9-10]，建立了醉魚(yú)草果實(shí)中黃酮類成分的含量測(cè)定方法。

1儀器與試劑

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-757CRT型，上海精科)；電子分析天平(AB135-S，瑞士METTLER TOLEDO)；HH-S恒溫水浴鍋(江蘇金壇市國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)；高速中藥粉碎機(jī)(FZ-02，浙江省溫嶺市百樂(lè)粉碎設(shè)備廠)。蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：100080-200306：中國(guó)藥品生物制品檢定所)；醉魚(yú)草果實(shí)(于2008年12月采自安徽舒城萬(wàn)佛山，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉守金教授鑒定為馬錢(qián)科植物醉魚(yú)草的果實(shí))；亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉，甲醇等均為分析純；水(實(shí)驗(yàn)室自制超純水)。

2方法及結(jié)果

2.1對(duì)照品及供試品溶液的制備精密稱取在五氧化二磷減壓干燥器中干燥36 h蘆丁對(duì)照品10.7 mg，置50 mL容量瓶中，甲醇溶解后定容至刻度即得；蘆丁對(duì)照品溶液濃度為0.214 g·mL-1。精密稱取醉魚(yú)草果實(shí)粗粉1 g，置50 mL圓底燒瓶中，加甲醇20 mL回流提取提取3次，每次1 h，合并濾液，并定容至100 mL，即得供試品溶液。

2.2檢測(cè)吸收波長(zhǎng)的確定分別精密吸取上述對(duì)照品溶液6.0 mL、供試品溶液3.0 mL，置25 mL容量瓶中，加蒸餾水至6 mL，再加入5%的NaNO2溶液1 mL，搖勻后靜置6 min；加10%Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻后靜置6 min；加4%NaOH溶液10 mL，加水定容至刻度，搖勻后靜置15 min。紫外—可見(jiàn)分光光度儀全波長(zhǎng)掃描的結(jié)果顯示，對(duì)照品及供試品溶液在510 nm波長(zhǎng)處顯示有較強(qiáng)吸收峰，因此選定510 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，見(jiàn)圖1。

注：(a)和供試品溶液(b)紫外掃描圖。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立分別精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，均加入蒸餾水至6 mL，按“2.2”項(xiàng)下步驟操作，以第一份作為空白對(duì)照，在510 nm處測(cè)定各對(duì)照品溶液的吸光度值。吸光度值分別為0.099,0.195,0.301,0.404,0.505,0.612。以吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，蘆丁對(duì)照品溶液濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：A=0.012 0C- 0.007 1 (r=0.999 8)，結(jié)果表明蘆丁在8.56~51.36 mg·L-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4精密度考察精密吸取同一供試品溶液1 mL，置25 mL容量瓶中，按“2.2”步驟中的方法顯色，重復(fù)測(cè)定6次，吸光度值分別為：0.247,0.246,0.246,0.245,0.248,0.247。計(jì)算其吸光度值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)=0.43%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5穩(wěn)定性考察分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各1 mL于25 mL容量瓶中，按“2.2”步驟操作，測(cè)定吸光度，每隔5 min測(cè)定一次，連續(xù)25 min，考察其顯色穩(wěn)定性。吸光度值分別為：0.247,0.245,0.245,0.241,0.243,0.242。結(jié)果表明，供試品及對(duì)照品溶液在顯色系統(tǒng)完全反應(yīng)后25 min內(nèi)，具有良好穩(wěn)定性。

2.6重復(fù)性考察分別精密稱取醉魚(yú)草果實(shí)粗粉1 g，共6份，按“2.2”步驟制備供試品溶液并測(cè)定其吸光度，吸光度值分別為：0.251,0.242,0.249,0.255,0.245,0.243。計(jì)算得藥材中總黃酮含量平均值為5.29%，RSD=1.83%。結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.7加樣回收率試驗(yàn)分別精密吸取含量已知的醉魚(yú)草果實(shí)供試品溶液1 mL，6份，置于25 mL容量瓶中，各加入蘆丁對(duì)照品溶液2.5 mL，按“2.2”步驟，測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率及RSD，結(jié)果見(jiàn)表1，表明本方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表1　加樣回收率試驗(yàn)

2.8樣品含量測(cè)定精密稱取醉魚(yú)草果實(shí)粗粉1 g，甲醇回流提取3次，每次1 h，濾液合并后，用甲醇定容至100 mL容量瓶，平行測(cè)定3組，按“2.2”步驟顯色并測(cè)定吸光度，計(jì)算得供試品中總黃酮含量分別為5.28%、5.32%、5.41%，平均含量為5.34%。

3討論

3.1供試品的提取醉魚(yú)草果實(shí)含多種黃酮類化合物，黃酮類化合物的提取實(shí)驗(yàn)前期分別采用純水、不同濃度的乙醇及甲醇作為提取溶媒，考察醉魚(yú)草果實(shí)中總黃酮含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇回流提取時(shí)，所測(cè)得藥材中總黃酮含量最高[11]，進(jìn)而選定甲醇為醉魚(yú)草果實(shí)藥材的提取溶劑。

3.2測(cè)定方法的確定黃酮成分的分析測(cè)定方法主要包括薄層掃描法、HPLC法、紫外分光光度法等。波層掃描法測(cè)定醉魚(yú)草果實(shí)中總黃酮的影響因素太多，測(cè)定結(jié)果不理想?？傸S酮中成分種類較多，通過(guò)HPLC法測(cè)定每個(gè)黃酮成分的含量，來(lái)測(cè)定總黃酮的含量也并不現(xiàn)實(shí)。醉魚(yú)草果實(shí)中黃酮類化合物的紫外區(qū)間的吸光度值雖不一致，但其黃酮母核能與亞硝酸鈉—硝酸鋁—?dú)溲趸c系統(tǒng)反應(yīng)，通過(guò)被亞硝酸鈉還原，再加硝酸鋁絡(luò)合，在堿性條件下顯紅色，在510 nm處有較強(qiáng)吸收，吸收峰穩(wěn)定無(wú)干擾，根據(jù)顯色后吸光度的不同，可實(shí)現(xiàn)對(duì)其黃酮類成分的測(cè)定，既能有效避開(kāi)其他成分對(duì)黃酮測(cè)定的影響，又能保證結(jié)果的準(zhǔn)確性[12]。在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，顯色反應(yīng)會(huì)隨著顯色溫度和顯色時(shí)間的變化而變化，25 min內(nèi)變化較緩，25 min后其吸光度值會(huì)下降，因此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制條件，盡量排除干擾。

本文以蘆丁為對(duì)照品，采用亞硝酸鈉—硝酸鋁—?dú)溲趸c法，測(cè)定醉魚(yú)草果實(shí)中黃酮類成分的總含量，結(jié)果顯示該法操作快速、簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為醉魚(yú)草果實(shí)總黃酮的含量測(cè)定方法。

3.3應(yīng)用前景醉魚(yú)草作為中醫(yī)的傳統(tǒng)藥材，但其果實(shí)的研究較少，這不利用醉魚(yú)草資源的綜合開(kāi)發(fā)，本研究通過(guò)紫外分光光度法測(cè)定醉魚(yú)草果實(shí)中總黃酮含量，建立了醉魚(yú)草果實(shí)總黃酮的含量測(cè)定方法，為醉魚(yú)草這一傳統(tǒng)藥用資源的綜合利用提供了參考依據(jù)。

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Determination of flavonoids in the fruits of

BuddlejalindleyanaFort.by ultraviolet spectrophotometry

XIAO Long-quan1,3,REN Ya-shuo2,3,WU De-ling2,3,et al

(1.ThePeople’sHospitalofBozhou,Anhui236804,China;2.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityof

TraditionalChineseMedicine,Anhui,Hefei230038,China;3.AnhuiKeyLaboratoryofModernized

ChineseMaterial,Hefei,Anhui230038,China)

Abstract:ObjectiveToestablishamethodfordeterminingtotalflavonoidsinthefruitofBuddleja lindleyanaFort.MethodsThecontentoftotalflavonoidswasdetectedbyultravioletspectrophotometry(US) .Itwasperformedonrutin(asacontrol)andasamplewithsodiumnitrite-aluminumnitrateandsodiumhydroxideascolor-developingagent.ResultsThegoodlinearitybetweenconcentrationsandabsorbanceofrutinwasfoundwithintherangeof8.56to51.36mg·L-1(A=0.012 0 C-0.007 1，r=0.999 8).Theaveragerecoverywas98.76%andrelativestandarddeviationwas1.74% (n=6).ThefruitofBuddleja lindleyanaFort.contained5.29%oftotalflavonoids.ConclusionsThismethodcanbeusedfordeterminingflavonoidsinthefruitofBuddleja lindleyanaFort.becauseofitsrapidness,simplicity,accuratenessandreliability.

Keywords:fruitsofBuddleja lindleyanaFort.;totalflavonoids;ultravioletspectrophotometry;contentdetermination

(收稿日期：2014-02-11，修回日期：2014-05-27)

通信作者：吳德玲，男，教授，研究方向： 中藥活性成分研究，E-mail:dlwu7375@sina.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(No81373841)；安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(NoKJ2013A170)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.02.017