葡萄籽原花青素對(duì)營(yíng)養(yǎng)肥胖模型大鼠腸道菌群的影響

宋雪琳, 李雅梅, 肖俊松,*, 吳 華, 曹雁平

（1.北京工商大學(xué)北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；2.江漢大學(xué)生命科學(xué)院，湖北 武漢 430070）

葡萄籽原花青素對(duì)營(yíng)養(yǎng)肥胖模型大鼠腸道菌群的影響

宋雪琳1, 李雅梅1, 肖俊松1,*, 吳 華2, 曹雁平1

（1.北京工商大學(xué)北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；2.江漢大學(xué)生命科學(xué)院，湖北 武漢 430070）

以高脂膳食喂養(yǎng)大鼠，復(fù)制營(yíng)養(yǎng)肥胖模型，然后灌胃原花青素，采用變性梯度凝膠電泳，實(shí)時(shí)熒光定量等不依賴微生物培養(yǎng)的手段和多元統(tǒng)計(jì)分析方法，研究葡萄籽原花青素對(duì)營(yíng)養(yǎng)肥胖模型大鼠腸道菌群生態(tài)的影響。結(jié)果表明，低劑量（100 mg/（kg·體重·d））原花青素可以顯著抑制大鼠肥胖，處理后大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與模型組分離；葡萄籽原花青素顯著降低了肥胖大鼠腸道菌群中厚壁菌門的含量，提高了擬桿菌門的含量，顯著降低了厚壁菌門與擬桿菌門比值；實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)顯示，原花青素可以促進(jìn)擬桿菌增殖，抑制柔嫩梭菌增殖，初步揭示出葡萄籽原花青素可能具有調(diào)節(jié)腸道菌群的功能；原花青素作用的關(guān)鍵微生物種屬為Blautia，Bacteroides，Lactobacillus，Anaerostipes，Clostridium，Anaerofilum。

葡萄籽原花青素；肥胖；腸道菌群；變性梯度凝膠電泳；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

腸道菌群是人體最大的菌庫(kù)，能夠?yàn)樗拗鳈C(jī)體提供本身不具有的酶系和生化代謝通路。腸道菌群不僅有增強(qiáng)免疫、解毒、促進(jìn)食物吸收與藥物代謝等功能，而且能夠通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)宿主脂肪吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、存儲(chǔ)和代謝全過(guò)程。腸道菌群作為人類的共生體，與人類體重及肥胖程度密切相關(guān)，可能是同遺傳、飲食等導(dǎo)致肥胖基本因子發(fā)生偶合的關(guān)鍵因素［1］。

原花青素是一類多酚類物質(zhì)，是以黃烷-3-醇（flavan-3-ol），如（+）-兒茶素（（+）-catechin）和（-）-表兒茶素（（-）-epicatechin）為單體，通過(guò)C4-C6或C4-C8鍵連接而成的聚合物。原花青素是植物重要的次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于人類膳食中，果蔬中含量尤其豐富。研究表明，原花青素具有良好的抗氧化、清除自由基、減肥消炎等生理作用［2-3］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，膳食中的原花青素等多酚類物質(zhì)的攝入能顯著降低肥胖、糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生概率［4］。Lee等［5］在研究原花青素對(duì)體外腸道菌群的影響中發(fā)現(xiàn)，原花青素能夠有效抑制腸道致病菌，而對(duì)益生菌的影響較小。

機(jī)體腸道菌群數(shù)量龐大，種類繁多，對(duì)機(jī)體正常生理活動(dòng)具有重要作用，因此對(duì)腸道菌群的認(rèn)識(shí)和研究具有重要意義。大多腸道菌都是厭氧菌，用傳統(tǒng)的分離、培養(yǎng)方法難以培養(yǎng)或目前的技術(shù)還不能夠?qū)ζ溥M(jìn)行培養(yǎng)，相應(yīng)的分析也難以進(jìn)行，只有低于30%的細(xì)菌可經(jīng)過(guò)目前的體外培養(yǎng)技術(shù)獲得［6-7］。本實(shí)驗(yàn)采用分子生物學(xué)手段如變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE），實(shí)時(shí)熒光定量（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，PCR（RT-PCR））等方法研究糞便中菌群DNA的組成變化情況，分析葡萄籽原花青素對(duì)營(yíng)養(yǎng)肥胖模型大鼠腸道菌群微生態(tài)環(huán)境的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

葡萄籽原花青素（純度≥95%），天津尖峰天然產(chǎn)物公司；瓊脂糖，美國(guó)賽默飛世爾公司；DNA回收試劑盒、DL2000 DNA Marker、dNTP、10×buffer、Taq DNA聚合酶，寶生物工程（大連）有限公司；引物合成，上海生物工程有限公司；去離子甲酰胺、丙烯酰胺、尿素、過(guò)硫酸銨、四甲基二乙胺，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；染料SYBR GreenⅡ，寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MyCycler型PCR儀，變性梯度凝膠電泳儀和iQ5型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司；Image Quant 300型凝膠成像儀，美國(guó)GE公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

SPF級(jí)Wistar雄性大鼠80只（90±10）g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，動(dòng)物房溫度25℃左右，濕度約60%，光照10～12 h/d，5只1籠。將80只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為2大組，一組70只作為模型組，另一組10只作為正常組。正常組和模型組分別給予基礎(chǔ)飼料和高脂飼料、花生、蛋黃喂養(yǎng)。造模期間大鼠自由攝食、飲水。模型組高于正常組體重20%時(shí)，認(rèn)為造模成功，進(jìn)行分組給藥。給藥期間，高、中、低劑量組分別按400，250，100 mg/（kg·d）的劑量以無(wú)菌水為溶劑給大鼠灌胃葡萄籽原花青素，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃低聚果糖1 g/（kg·d），模型對(duì)照和正常組灌胃無(wú)菌水。灌胃6周后，收集大鼠糞便樣本至-80℃冰箱保存。

1.3.2 糞便細(xì)菌總DNA的提取

稱量約200 mg的糞便樣本，加入10 mL 0.1 mol/L，pH值為7.0的無(wú)菌磷酸鈉緩沖液中，充分震蕩懸浮5～10 min，500 r/min離心5 min，收集上清液。重復(fù)該步驟2～3次，上清液10 000 r/min離心10 min。收集沉淀，將沉淀懸浮于10 mL的緩沖液中，10 000 r/min離心5 min，洗滌沉淀，重復(fù)2～3次，最后收集沉淀。在菌體沉淀中加入570 μL TE buffer，反復(fù)吹打使之懸浮，加入30 μL 10%的十二烷基磺酸鈉和10 μL蛋白酶K，混勻后37℃溫育1 h；加入100 μL 5M NaCl，充分混勻加入80 μL，65℃預(yù)熱的十六烷基三甲基溴化銨裂解液，混勻后65℃溫育10 min；加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1），混勻，12 000 r/min離心10 min，直至有機(jī)相和水相間不再有蛋白質(zhì)；轉(zhuǎn)移上清液至新的1.5 mL EP管中，加入約0.7倍體積的異丙醇，輕輕混勻沉淀DNA至少1 h，12 000 r/min離心5 min；棄上清液，沉淀用70%的乙醇1 mL洗滌，12 000 r/min離心10 min，棄上清液，重復(fù)一次；干燥后加30 μL TE buffer，輕彈管壁使其混勻，-20℃保存。

1.3.3 DGGE條件的確定

采用通用引物擴(kuò)增16S rDNA基因V3可變區(qū)。擴(kuò)增引物序列（上游引物341fGC：5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGC CTACGGGAGGCAGCAG-3'。下游引物518r：5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'）目的片段基因200 bp。PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系（25 μL）：0.13 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），2.5 μL 10×buffer（Mg2+Plus），2 μL dNTPs（各2.5 mM），上下游引物各0.5 μL，DNA模板0.5 μL，加無(wú)菌雙蒸水將體積補(bǔ)足至25 μL。采用降落PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，65℃退火1 min，72℃延伸1 min，執(zhí)行20個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.5℃；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，再執(zhí)行5個(gè)循環(huán)。將瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增合格樣品進(jìn)行復(fù)原條件PCR（50 μL）擴(kuò)增，滴入0.25 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），5.0 μL 10×buffer（Mg2+Plus），4 μL dNTPs（各2.5 mM），上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，加無(wú)菌雙蒸水將體積補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)體系：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；72℃維持5 min。將瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格樣品進(jìn)行DGGE。

DGGE采用7.5%的聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度范圍25%～55%，上樣量為40 μL樣本和10 μL loading buffer，電泳緩沖液為1×TAE，電壓45 V，60℃電泳15 h，電泳結(jié)束后溴化乙錠染色20 min，然后用水漂洗20 min，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)成像。PCR擴(kuò)增條帶切膠回收純化，送北京華大基因TA克隆測(cè)序。將測(cè)序得到的16S rDNA序列在Genebank上進(jìn)行序列比對(duì)，得到每條條帶菌所屬的類別，并比較不同泳道（組別）樣本中不同門類菌的相對(duì)含量。

1.3.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

采用特異性引物進(jìn)行PCR，純化PCR產(chǎn)物，測(cè)定其濃度，并根據(jù)其分子量計(jì)算其拷貝數(shù)，即得相應(yīng)菌屬的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。各菌屬擴(kuò)增引物及條件為：

乳酸菌屬特異性擴(kuò)增［8］。引物L(fēng)ac1：5'-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3'。Lac2：5'-ATTYCACCGCTACACATG-3'。擴(kuò)增體系同1.3.3中25 μL體系。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，61℃退火1 min，72℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。

擬桿菌特異性擴(kuò)增［9］。引物Bfr-F：5'-CTGAACCAGCCAAGTAGCG-3'。Bfr-R：5'-CCGCAAACTTTCACAACTGACTTA-3'。擴(kuò)增體系同1.3.3中25 μL體系。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

柔嫩梭菌特異性擴(kuò)增［10-11］。引物Clep-F：5'-GCACAAGCAGTGGAGT-3'。Clep-R3：5'-CTTCCTCCGTTTTGTCAA-3'。擴(kuò)增體系同1.3.3中25 μL體系。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性20 s，50℃退火20 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

1.3.5 特定菌屬的RT-PCR檢測(cè)

質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，獲得系列拷貝數(shù)梯度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，以此為模板進(jìn)行RT-PCR。以PCR反應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)，初始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

不同菌屬的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（25 μL）的擴(kuò)增體系：12.5 μL染料SYBR GreenⅡ，上下游引物各1 μL，DNA模板或者質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品1 μL，雙蒸水9.5 μL。乳酸菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；55℃保持10 s后，讀取反應(yīng)管中的熒光信號(hào)。擬桿菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；55℃保持10 s后，讀取反應(yīng)管中的熒光信號(hào)。柔嫩梭菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性10 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；55℃保持10 s后，讀取反應(yīng)管中的熒光信號(hào)。每個(gè)樣本重復(fù)3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中該菌初始拷貝數(shù)，換算成每克糞便樣本中該菌的初始拷貝數(shù)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Quantity One軟件對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理；采用SIMCA 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析PCA，PLS-DA分析；采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)；采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠體重變化情況

造模成功后，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)給藥處理6周，每周測(cè)量各組大鼠體重，體重動(dòng)態(tài)變化如圖1。

圖1 營(yíng)養(yǎng)肥胖模型大鼠灌胃原花青素期間體重變化Fig.1 Change of body weight of diet-induced obesity rats treated with grape seed procyanidins

從圖1可以看出，灌胃初期，灌胃組和模型組體重幾乎沒(méi)有差異，均高于正常組體重20%。隨著灌胃時(shí)間的延長(zhǎng)，高、中、低劑量原花青素灌胃組體重相較于模型組體重均有所減輕。第5周低劑量組體重顯著低于模型組（P＜0.05），第6周中、低劑量組體重均顯著低于模型組（P＜0.05）。高劑量組和陽(yáng)性組體重有降低趨勢(shì)，但不顯著。

2.2 DGGE分析

將檢測(cè)合格的各組大鼠糞便DNA樣品，進(jìn)行DGGE分析，染色后凝膠成像得到DGGE圖譜如圖2。

從圖2中可以看出，不同組別的DGGE圖譜存在相似和不同的條帶，但直觀上難以看出區(qū)別。故采用Quantity one軟件數(shù)字化處理，每個(gè)條帶的光密度值可作為該條帶所代表的微生物類群的豐度值，歸一化處理后得到其相對(duì)豐度。不同泳道上相同位置的條帶視為相同的微生物類群，作為一個(gè)變量，最終分析了33個(gè)不同位置條帶，故有33個(gè)變量。樣品按行整理，指標(biāo)（33個(gè)菌群）按列整理，得到了16 ×33的數(shù)據(jù)矩陣。

采用SIMCA 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)降維分析和可視化呈現(xiàn)，嘗試主成分分析法（PCA，principal component analysis）和偏最小二乘判別分析（PLS-DA，partial least squares-discriminant analysis）。運(yùn)用PCA嘗試發(fā)現(xiàn)反映事物主要特征的變量，反應(yīng)樣品的特征，解釋實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象；PLS-DA利用現(xiàn)有的樣本判別模型，分析組間差異較小而組內(nèi)差異較大的數(shù)據(jù)，消除隨機(jī)誤差，有利于發(fā)現(xiàn)組間差異和差異條帶。兩種模型分析結(jié)果如圖3。

圖2 各組大鼠腸道菌群16S rRNA V3可變區(qū)DGGE圖譜Fig.2 DGGE electropherogram of 16S rRNA V3 variable region of gut microflora in rats

圖3 DGGE條帶的PCA和PLS-DA分析Fig.3 Analysis of DGGE data using PCA and PLS-DA methods

圖3（a）顯示，低劑量組、陽(yáng)性組和正常組較為接近，高劑量組則和模型組較為接近，說(shuō)明低劑量組和陽(yáng)性組腸道菌群有向正常轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)。圖3（b）顯示，模型組與正常組距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明高脂膳食確實(shí)顯著改變了腸道菌群；高劑量組與模型組距離較近，說(shuō)明高劑量組對(duì)腸道菌群影響不大；低劑量組、正常組分別分布于第一和第二象限，其腸道菌群結(jié)構(gòu)與模型組有較大區(qū)別，說(shuō)明低劑量原花青素能改變高脂肥胖大鼠體內(nèi)腸道菌群結(jié)構(gòu)。

圖3（c）為因子載荷圖。以“VIP”值大于1為標(biāo)準(zhǔn)，初步篩選對(duì)解釋組間差異重要的條帶，共計(jì)15條，分別為B1，B2，B12，B13，B16，B17，B18，B19，B23，B24，B25，B27，B28，B31。多重比較顯示，與模型組相比，低劑量組B1，B2，B12，B13，B16，B23，B25，B27條帶的相對(duì)豐度有顯著差異（P＜0.05，陽(yáng)性組與正常組因只有2個(gè)樣本，未作多重比較）。

2.3 各組別的菌群結(jié)構(gòu)分析

所有36個(gè)條帶割膠測(cè)序，在16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)，以相似度＞95%為標(biāo)準(zhǔn)選取參考菌株，用Mega 6.0軟件Neighbour-Joint法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)條帶所代表的微生物種群進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果圖4。圖4顯示，原花青素作用的部分關(guān)鍵菌群為條帶B1（Blautia spp.），B2（Bacteroides spp.），B12（Lactobacillus spp.），B13（Anaerostipes spp.），B16（Blautia spp.），B17（Blautia spp.），B18（Clostridium spp.），B19（Anaerostipes spp.），B23（Lactobacillus spp.），B24（Lactobacillus spp.），B25（Lactobacillus spp.），B27（Anaerofilum spp.）。大部分為目前已知的腸道微生物，說(shuō)明該方法對(duì)主要微生物類群有較好的分析效果，但是含量較少的微生物，由于提取的DNA量有限，無(wú)法在電泳上分離。

根據(jù)鑒定結(jié)果，分析各個(gè)條帶所代表的菌的類群。根據(jù)分析結(jié)果按照門（phylum），綱（class），目（order）對(duì)腸道菌群進(jìn)行歸類，得到腸道菌群主要類群的相對(duì)豐度值分布如圖5。

從圖5可以看出，各組大鼠腸道菌群主要由擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）三個(gè)門構(gòu)成，與Hildebrandt等［10］的研究比較，缺少柔膜菌門（Tenericutes）。各組大鼠的腸道菌群以厚壁菌門所占比例最多，且其中梭狀芽胞桿菌綱（Bacillales）所占比例最大，其次為乳桿菌目（Lactobacillales）和芽孢桿菌目（Bacillales）。

圖5 大鼠腸道菌群主要細(xì)菌類群的相對(duì)豐度分析Fig.5 Relative content of main bacteria groups in gut microflora of rats

對(duì)厚壁菌門和擬桿菌門的微生物相對(duì)豐度進(jìn)行比較結(jié)果見(jiàn)圖6.由圖6可以發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，正常組、陽(yáng)性對(duì)照組、高劑量組厚壁菌門細(xì)菌含量顯著降低；正常組、陽(yáng)性對(duì)照組、高劑量組擬桿菌門含量顯著增加，且以陽(yáng)性對(duì)照組最好；厚壁菌門與擬桿菌門比值各組與模型組相比都有顯著降低。

圖6 各組大鼠腸道菌群中厚壁菌門和擬桿菌門相對(duì)豐度的比較Fig.6 Comparison of Firmicutes and Bacteroidetes and their ratio in gut microflora of different rat groups

2.4 RT-PCR定量

根據(jù)DGGE條帶計(jì)算微生物相對(duì)豐度值，受到微生物16S rRNA序列擴(kuò)增效率的干擾，結(jié)果有一定的失真。因此，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RTPCR）對(duì)腸道中比較重要的3個(gè)微生物類群乳酸菌（lactic acid bacteria）、擬桿菌（Bacteriodes spp.）、柔嫩梭菌（Clostridium leptum）進(jìn)行定量，結(jié)果如圖7。

圖7 葡萄籽原花青素對(duì)營(yíng)養(yǎng)肥胖大鼠腸道乳酸菌、擬桿菌、柔嫩梭菌豐度的影響Fig.7 Effects of GSP on the content of lactic acid bacteria，Bacteriodes and Clostridium leptum in gut microflora of DIO rats

由圖7可見(jiàn)，各組大鼠腸道菌群中乳酸菌豐度無(wú)顯著區(qū)別，提示低聚果糖、原花青素對(duì)乳酸菌豐度無(wú)顯著影響，可能與乳酸菌在腸道中豐度本來(lái)就很低有關(guān)；原花青素高劑量組擬桿菌豐度顯著高于模型組，達(dá)到與正常組無(wú)顯著區(qū)別水平，低聚果糖亦有類似效果，說(shuō)明高劑量原花青素可以促進(jìn)擬桿菌增殖，達(dá)到與正常大鼠相同的水平；低劑量原花青素組柔嫩梭菌豐度顯著低于模型組，而其他各組無(wú)顯著區(qū)別。

擬桿菌也稱類桿菌，是厭氧、糖發(fā)酵、有膽汁抗性且不形成孢子的革蘭氏陰性桿菌，是人體腸道內(nèi)菌群數(shù)量最大的微生物之一，大約占腸道內(nèi)細(xì)菌細(xì)胞總數(shù)的25%以上。擬桿菌具有參與人體的營(yíng)養(yǎng)吸收以及維持腸道的正常生理的作用。擬桿菌可以吸收和降解膳食中人體不能夠降解的多種植物多糖，參與脂肪代謝，調(diào)節(jié)細(xì)菌毒素的產(chǎn)生與增強(qiáng)宿主固有的免疫反應(yīng)等，有研究表明，擬桿菌豐度的增加可能有益健康，柔嫩梭菌與某些疾病，如結(jié)腸癌，潰瘍性結(jié)腸炎有關(guān)，其豐度的減少可能會(huì)有助于人體健康［12］。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出，葡萄籽原花青素和低聚果糖能夠提高機(jī)體腸道中擬桿菌的豐度，降低柔嫩梭菌的豐度，具有調(diào)整腸道菌群的作用。

3 結(jié) 論

近年研究表明，腸道菌群異?？赡苁欠逝职l(fā)生的原因［13］。長(zhǎng)期的高脂膳食會(huì)導(dǎo)致腸道菌群微生態(tài)環(huán)境的紊亂，腸道通透性異常增加，內(nèi)毒素、鞭毛蛋白等外界抗原透過(guò)腸道壁進(jìn)入血液，導(dǎo)致慢性炎癥反應(yīng)，誘發(fā)肥胖，糖尿病等慢性代謝性疾?。?4-15］。本研究表明，即使灌胃期間仍然給予高脂膳食，和對(duì)照組相比，葡萄籽原花青素也顯著抑制大鼠體重的增長(zhǎng)。抑制效果以低劑量組原花青素最佳，說(shuō)明原花青素可能不是通過(guò)抑制相關(guān)消化酶類，從而抑制營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收來(lái)抑制體重增長(zhǎng)。原花青素可能通過(guò)改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，修復(fù)腸道通透性，從而抑制腸道內(nèi)毒素進(jìn)入血液誘發(fā)炎癥反應(yīng)來(lái)抑制肥胖發(fā)生。

對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的分析部分證實(shí)了原花青素通過(guò)腸道菌群抑制肥胖的假設(shè)，低劑量原花青素能使大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)離模型組；DGGE的分析結(jié)果表明，腸道中各種微生物的相對(duì)豐度發(fā)生了顯著變化。從門的水平來(lái)看，高脂膳食喂食的肥胖大鼠腸道菌群中厚壁菌門所占的比例更高，擬桿菌門所占的比例相對(duì)較少。葡萄籽原花青素和低聚果糖都能夠有效降低營(yíng)養(yǎng)肥胖型大鼠腸道菌群中厚壁菌門的量，增加擬桿菌門的量，提高F/B比值，說(shuō)明葡萄籽原花青素能夠改善肥胖模型大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)。RT-PCR定量研究也發(fā)現(xiàn)，原花青素可以促進(jìn)有益的擬桿菌增殖，抑制有害的柔嫩梭菌增殖，對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群具有顯著的調(diào)節(jié)作用。

肥胖與腸道菌群中的擬桿菌門和厚壁菌門豐度密切相關(guān)，它們能夠影響腸道菌群的代謝能力［16-17］。Ley等［11］研究發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠中厚壁菌門比例增加，擬桿菌門比例降低，比值增加。人體試驗(yàn)也表明，體質(zhì)指數(shù)的下降伴隨著腸道擬桿菌門細(xì)菌的豐度逐漸升高［16-17］。本研究與Ley等的結(jié)果一致，揭示原花青素可能通過(guò)降低厚壁菌門，增加擬桿菌門微生物含量，起到減肥效果。

本研究受限于變性梯度凝膠電泳技術(shù)本身的精度，無(wú)法對(duì)腸道中豐富的微生物類群進(jìn)行深度分析，因此，接下來(lái)將采用宏基因組測(cè)序技術(shù)等，考察原花青素對(duì)腸道菌群的具體影響。

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Effect of Grape Seed Proanthocyanidins on Gut Microbiota of Diet-Induced-Obesity Rats

SONG Xuelin1， LI Yamei1， XIAO Junsong1，*， WU Hua2， CAO Yanping1
（1.Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry/Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives/Beijing Laboratory for Food Quality and Safety，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China；2.College of Life Sciences，Jianghan University，Wuhan 430070，China）

Wistar rats were fed with high fat diet to induce the diet-induced obesity model（DIO），and then gavaged with grape seed proanthocyanidins（GSP）of different doses.Culture-independent methods such as denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE）and real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction（real-time PCR）were applied，coupled with multivariate analysis，to explore the effect of GSP on the microbiota of DIO rats.Results showed that GSP treatment（100 mg/（kg·bw·d））could inhibit high-fat induced obesity，and its gut microbiota profile was separated from that of the model group. Results also suggested that GSP-treated groups had the lower Firmicutes content and higher Bacteroidetes

content and the ratio of Firmicutes to Bacteroidetes increased in this group.Real-time-PCR results indicated that GSP promoted the proliferation of Bacteriodes spp.and inhibited that of Clostridium leptum.The key genera the GSP might have an effect on were as follows：Blautia，Bacteroides，Lactobacillus，Anaerostipes，Clostridium，Anaerofilum.

grape seed proanthocyanidins；obesity；gut microbiota；denaturing gradient gel electrophoresis；real time-PCR

葉紅波）

TS201.3

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.05.007

2095-6002（2015）05-0039-08

宋雪琳，李雅梅，肖俊松，等.葡萄籽原花青素對(duì)營(yíng)養(yǎng)肥胖模型大鼠腸道菌群的影響［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2015，33（5）：39-46.

SONG Xuelin，LI Yamei，XIAO Junsong，et al.Effect of grape seed proanthocyanidins on gut microbiota of diet-inducedobesity rats［J］.Journal of Food Science and Technology，2015，33（5）：39-46.

2015-01-11

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31201323）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD23B02）；北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進(jìn)與培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（0142132014）。

宋雪琳，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣δ苁称罚?肖俊松，男，副教授，博士，主要從事功能食品方面的研究。通信作者。