禽流感病毒H9和N2亞型雙重RT-PCR檢測方法的建立

徐 倩，謝芝勛，謝麗基，鄧顯文，謝志勤，羅思思，黃 莉，黃嬌玲，曾婷婷

(1.廣西大學動物科技學院，廣西南寧 530001；2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點實驗室， 廣西南寧 530001)

禽流感病毒H9和N2亞型雙重RT-PCR檢測方法的建立

徐 倩1，謝芝勛2*，謝麗基2，鄧顯文2，謝志勤2，羅思思2，黃 莉2，黃嬌玲2，曾婷婷2

(1.廣西大學動物科技學院，廣西南寧 530001；2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點實驗室， 廣西南寧 530001)

為建立簡便快速檢測H9及N2亞型禽流感病毒(AIV)的方法，根據(jù)AIV H9亞型和N2亞型基因序列，分別設(shè)計了2對針對H9亞型AIV的HA基因和N2亞型AIV的NA基因的引物，建立了H9亞型和N2亞型AIV雙重RT-PCR檢測方法。對H9N2亞型AIV的RNA模板進行RT-PCR擴增，可得到545 bp H9基因特異性條帶和341 bp N2基因的特異性條帶；對非H9亞型的N2亞型AIV進行擴增，則僅出現(xiàn)1個特異性擴增條帶，即341 bp N2基因條帶；對非H9或N2亞型AIV和其他禽呼吸道病原體進行PCR擴增，結(jié)果均為陰性。結(jié)果表明該雙重RT-PCR最低能檢出100 fg H9N2亞型AIV的cDNA模板。

禽流感病毒；H9亞型；N2亞型；雙重逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)屬于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)A型流感病毒屬流感病毒，能夠引起禽類的感染和疾病。目前按照A型流感病毒囊膜糖蛋白血凝素(hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)的差異，可將其分為18個HA亞型(H1～H18)和11個NA亞型(N1～N11)[1-3]。其中H9亞型禽流感雖然屬于低致病性禽流感，但是該亞型流感病毒一直在我國的一些主要養(yǎng)禽地區(qū)傳播和流行并形成地方流行性疫病[4-5]。1996年-2000年，我國H9N2亞型禽流感的發(fā)病率占總禽流感發(fā)病率的93.89%，成為影響我國養(yǎng)禽業(yè)的主要AIV亞型[6]。Peng Y等[7]在對我國廣西地區(qū)開展的H9亞型AIV流行病學調(diào)查中發(fā)現(xiàn)H9亞型AIV在禽群中仍然廣泛流行。不僅如此，H9亞型AIV還可以感染人、豬等哺乳動物，具有重要的公共衛(wèi)生意義[8]。N2亞型是能導致禽類感染的常見AIV亞型，在中國主要是H9N2亞型。

目前，對于H9N2亞型AIV的檢測，主要是病原學分離鑒定與血清學試驗，但是這些方法存在耗時長和敏感性差等不足，并且不能同時檢測出H9亞型及N2亞型AIV。雙重及多重RT-PCR可同時檢測不同病原體(或不同亞型病原體)，在臨床上具有較高的應(yīng)用價值，并且由于其具有特異性好及敏感性高的優(yōu)點而得到了廣泛的應(yīng)用[9-13]。本研究設(shè)計2對特異性引物，建立了H9亞型和N2亞型禽流感病毒的雙重RT-PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF雞胚為北京梅里亞公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器和試劑 NanoDrop 2000 超微量分光光度計為美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品； Hema 9700梯度基因擴增儀為中國珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司產(chǎn)品；病毒DNA/RNA抽提試劑盒、2×EasyTaqPCR SuperMix為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、DNA Marker DL 1 000為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.3 病毒株 H1N1、H1N2、 H3N2、H3N6、H3N8、H4N2、H4N6、 H6N2、H6N6及H9N2亞型禽流感病毒株由廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點實驗室分離鑒定，H5N2、H7N2亞型AIV RNA由美國賓夕法尼亞州立大學禽病診斷研究室惠贈，新城疫病毒(NDV) La Sota、傳染性支氣管炎病毒(IBV)M41、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)北京、雞毒支原體(MG)S6及番鴨呼腸病毒(ARV)由廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點實驗室保存提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中H9亞型AIV的HA基因和N2亞型AIV的NA基因的核苷酸序列，用DNA Star軟件進行比對，以GenBank中1條雞源H9N2亞型AIV-HA基因(登錄號為JQ770141.1)和1條雞源H9N2亞型AIV-NA基因(登錄號為AF156398.1)為參考序列，用Primer 5.0生物軟件設(shè)計針對H9亞型、N2亞型AIV的2對特異性引物，引物核酸序列見表1。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，儲存液濃度為25 pmol/μL，置-30 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 H9、N2引物的核苷酸序列Table 1 Nucleotide sequences of H9 and N2 primers

1.2.2 病毒RNA/DNA抽提與RNA反轉(zhuǎn)錄 參照Viral DNA/RNA Kit使用說明書對所用的病毒RNA或DNA進行抽提，抽提后的RNA或DNA分別用33 μL、50 μL DEPC水溶解。向RNA抽提產(chǎn)物中加入1.5 μL 反轉(zhuǎn)錄引物，70 ℃ 10 min，冰浴5 min，加入反轉(zhuǎn)錄體系：10 μL 5×AMV buffer、4 μL dNTP、0.5 μL RNA酶抑制劑、1 μL AMV，瞬時離心，42 ℃ 90 min制備cDNA。所得到的DNA及cDNA置-30 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 雙重RT-PCR擴增條件的優(yōu)化 通過對雙重PCR 的引物濃度配比及反應(yīng)參數(shù)(包括時間和溫度)進行優(yōu)化，篩選出雙重RT-PCR最佳反應(yīng)體系及反應(yīng)條件。

1.2.4 雙重RT-PCR的特異性試驗 用已優(yōu)化的雙重PCR方法，分別對H9N2、H1N1、H1N2、 H3N2、H3N6、H3N8、H4N2、H4N6、H5N2、H6N2、H6N6、H7N2亞型AIV、NDV、IBV、ILTV、ARV及MG的核酸進行擴增，以檢測建立的雙重RT-PCR的特異性。同時，用已優(yōu)化的雙重PCR方法，分別對20株廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點實驗室保存的，廣西地區(qū)不同年份(近4年)不同宿主的H9N2亞型AIV進行擴增，評價所建立的雙重RT-PCR方法的實用性。毒株背景如表2所示。

1.2.5 雙重RT-PCR的敏感性試驗 利用超微量分光光度計測定H9N2亞型AIV cDNA模板的濃度，并用超純水將其倍比稀釋成10和1 ng/μL、100、10和1 pg/μL、100、10和1 fg/μL。用本研究中上述最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行擴增。

1.2.6 臨床樣品檢測 應(yīng)用所建立的雙重RT-PCR方法,隨機選擇120份從廣西南寧市活禽市場

采集的口腔和糞便拭子進行檢測。同時將相同的120份臨床樣品，用傳統(tǒng)雞胚接種的方法進行病原分離，并與雙重PCR檢測的結(jié)果進行比較。對雙重RT-PCR檢測為陽性的樣品，進行HA、NA基因全長擴增并克隆測序，驗證雙重RT-PCR所得結(jié)果。

表2 20株H9N2亞型AIV毒株背景Table 2 Background of 20 strains of H9N2 subtype AIVs

2 結(jié)果

2.1 雙重RT-PCR條件的優(yōu)化

通過對H9和N2亞型AIV基因引物濃度的測定及雙重PCR擴增的溫度、時間等的優(yōu)化，最后確定雙重PCR最佳反應(yīng)體系：2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL，H9N2亞型 AIV cDNA共1 μL作為模板，引物H9-F、H9-R(25 pmol/μL)各加入0.5 μL，N2-F、N2-R(25 pmol/μL)各0.3 μL，最后用三蒸水補充至25 μL。雙重PCR的最佳反應(yīng)條件為：94 ℃預變性 5 min；94 ℃ 40 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，35個循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。

2.2 雙重RT-PCR的特異性

所建立的雙重RT-PCR方法，對H9N2亞型AIV 的擴增出現(xiàn)2條與試驗設(shè)計大小相符的條帶(545 bp和341 bp)；對H1N2、H3N2、H4N2、H5N2、H6N2、H7N2亞型AIV的擴增出現(xiàn)了1個條帶(314 bp)，而對H1N1、H3N6、H3N8、H4N6、H6N6亞型AIV核酸和對NDV、IBV、ILTV、MG及ARV核酸的擴增未出現(xiàn)任何條帶。擴增結(jié)果如圖1所示。以上結(jié)果均與預期結(jié)果相一致，說明所建立的雙重RT-PCR方法具有良好的特異性。對20株不同年份、不同宿主的H9N2亞型AIV進行擴增后，均出現(xiàn)2條與試驗設(shè)計大小相符的條帶，擴增結(jié)果如圖2所示。

2.3 雙重RT-PCR的敏感性

敏感性試驗結(jié)果表明，該雙重RT-PCR最低能檢出100 fg H9N2亞型AIV cDNA模板。擴增結(jié)果如圖3所示。

2.4 臨床樣品檢測結(jié)果

120份從廣西南寧市活禽市場采集的口腔和糞便拭子樣品，經(jīng)雙重RT-PCR檢測，有11份呈H9N2亞型AIV陽性，陽性率為9.17%；18份呈N2亞型(非H9亞型)AIV陽性，陽性率為15%，91份呈陰性。其中樣品編號為1～20的樣品電泳結(jié)果如圖4所示，該結(jié)果與病毒分離鑒定結(jié)果相一致。測序結(jié)果表明，雙重RT-PCR擴增的為H9 亞型AIV的HA基因和N2亞型AIV的NA基因。檢測結(jié)果說明，所建立的雙重RT-PCR方法具有較好的臨床實用性。

圖1 雙重RT-PCR 的特異性Fig.1 Specificity results of duplex RT-PCR

圖2 雙重RT-PCR對20株H9N2亞型AIV毒株擴增結(jié)果Fig.2 The detection results of 20 strains of H9N2 AIVs by duplex RT-PCR

圖3 雙重RT-PCR 的敏感性Fig.3 Sensitivity results of duplex RT-PCR

圖4 雙重RT-PCR臨床樣品檢測結(jié)果Fig.4 The detection results of clinical samples by duplex RT-PCR

3 討論

H9亞型禽流感病毒雖然為低致病性禽流感病毒，但是由于其自20世紀90年代出現(xiàn)了感染人的事例，并且一些病毒呈現(xiàn)出了人類流感病毒樣受體特異性，引起了全世界的關(guān)注[14-16]。借助Influenza Virus Resource網(wǎng)站可以查詢到GenBank中公布的中國地區(qū)H9亞型AIV序列中，除了個別為H9N1和H9N6亞型外，絕大均為H9N2亞型。值得注意的是，2013年流行的H7N9 AIV各基因節(jié)段中，除了HA和NA基因，其他重組來源均來自H9N2[17]。建立一種直觀、簡便的方法檢測出H9N2亞型AIV是十分必要的。N2亞型是我國所流行的AIV中比較常見且比較重要的亞型，但以往的AIV的多重RT-PCR所建立的方法，多為針對HA基因，而對于NA基因的檢測相對較少。因此，本研究分別針對H9亞型AIV的HA基因和N2亞型AIV的NA基因設(shè)計2對引物，同時擴增H9亞型和N2亞型AIV的目的片段，不僅可以直接檢測出H9N2亞型AIV，還可以初步確定H9亞型AIV和N2亞型AIV，可為H9、N2亞型AIV提供準確快速的檢測結(jié)果。

病原學分離鑒定與血清學試驗方法操作相對繁瑣，且各亞型之間容易相互影響[18]，敏感性相對較低。本研究所建立的雙重RT-PCR的方法，對于H9亞型AIV和N2亞型AIV的檢測均可出現(xiàn)與試驗設(shè)計大小相符的條帶，而對于其他亞型AIV及其他禽呼吸道疾病病原的擴增結(jié)果均為陰性，表現(xiàn)出較好的特異性；通過敏感性試驗，本方法最低能檢出100 fg的H9N2亞型AIV模板，證明該方法的敏感性較高。臨床樣品檢測結(jié)果及基因測序結(jié)果相比較，該方法表現(xiàn)了高度的準確性、簡便性。值得注意的是，由于受到實驗條件的限制，并不能用所建立的方法對所有HA亞型和NA亞型進行檢測驗證，因此尚需要對更多的臨床樣品進行檢測，以評價其在實際應(yīng)用中的檢測效果?？傊狙芯克⒌碾p重RT-PCR對于同時檢測H9亞型和N2亞型AIV具有方便快捷、特異性良好、敏感性較高的特點，對H9、N2亞型AIV的監(jiān)測和防控有重要意義。

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Development of Duplex RT-PCR Assay for Detection of AIV H9 and N2 Subtype

XU Qian1,XIE Zhi-xun2,XIE Li-ji2,DENG Xian-wen2,XIE Zhi-qin2,LUO Si-si2,HUANG Li2,HUANG Jiao-ling2,ZENG Ting-ting2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi,530004,China; 2.GuangxiVeterinaryResearchInstitute,GuangxiKeyLaboratoryofAnimalVaccinesandDiagnostics,Nanning,Guangxi,530001,China)

A duplex reverse transcription-polymerase chain reaction(duplex RT-PCR)was developed to detect H9 and N2 subtype avian influenza viruses(AIVs)simultaneously. Two pairs of specific primers were designed according to the conserved regions on the sequences of H9 AIV-HA gene and N2 AIV-NA gene in GenBank. It was shown that all samples containing H9N2 subtype AIV could be amplified into two specific bands, 545 bp for H9 subtype AIV and 341 bp for N2 subtype AIV by this duplex RT-PCR. All samples containing N2 subtype AIV with different HA genes (not H9) could be amplified into one specific band, 341 bp for N2 subtype AIV. No specific bands of the same sizes were amplified from other subtypes of AIVs and other avian pathogenic virus. As little as 100 fg of H9N2 subtype AIV could be detected by this duplex RT-PCR.

Avian influenza virus;H9 subtype;N2 subtype;duplex RT-PCR

2014-05-28

廣西特聘專家專項項目(2011B020)；廣西自然科學基金項目(2013GXNSFDA019015)；廣西科技攻關(guān)重大專項項目(1222003-2-4)；桂漁牧科項目(14-1)

徐 倩(1987-)，女，河北石家莊人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)生物技術(shù)學研究。*

S852.659.5;Q789

:A

:1007-5038(2015)01-0011-05