嗎替麥考酚酯對SD大鼠抗腎小球基底膜腎炎模型的治療效果

方 珣，劉昌璇，陳文莉

（武漢市中心醫(yī)院腎內(nèi)科 430014）

抗腎小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）相關(guān)疾病是由于機(jī)體對Ⅳ型膠原的耐受性失調(diào)，針對Ⅳ型膠原α3鏈的非膠原區(qū)產(chǎn)生自身抗體，進(jìn)而引起呼吸系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)等相關(guān)器官出現(xiàn)病變的一系列自身免疫疾?。?-2］。GBM 腎炎就是由抗GBM 抗體引起的一類腎臟疾病，該病患者可在外周血中檢測到大量的抗GBM 抗體，臨床上表現(xiàn)為腎功能嚴(yán)重下降，幾周內(nèi)即可進(jìn)展至腎功能衰竭，并伴有新月體出現(xiàn)。該病起病急促，病情發(fā)展迅速，預(yù)后差，沒有較理想的治愈方法，病死率較高［3］。

嗎替麥考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）是鳥嘌呤核苷酸經(jīng)典合成途徑中的重要限速酶-次黃嘌呤單核苷酸脫氫酶（IMPDH）的選擇性抑制劑［4］，其代謝產(chǎn)物霉酚酸（MPA）可抑制高度依賴經(jīng)典合成途徑增殖的T、B 淋巴細(xì)胞，而對鳥嘌呤核苷酸補(bǔ)救合成途徑無影響［5-6］。因此MMF對其他細(xì)胞無抑制作用，無肝、腎毒性，不會引起骨質(zhì)疏松、高血壓等不良反應(yīng)，骨髓抑制作用也大大弱于其他類非選擇性免疫抑制劑。作為一種新型免疫抑制劑，MMF多被用于器官移植以及一些自身免疫疾病，如自身免疫性肝病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和自身免疫性胰腺炎等疾病的治療［7-9］，但在抗GBM 腎炎治療上的研究報道較少。本文通過觀察MMF 治療組大鼠24h 蛋白尿排泄量、血肌酐、尿素氮、IL-1和TGF-β1等生化指標(biāo)以及腎臟組織病理形態(tài)學(xué)變化的情況，研究MMF 對抗GBM 腎炎SD 大鼠模型的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動物及材料

1.1.1 實驗動物 40只SD 大鼠，8周齡，體質(zhì)量200g左右，雌雄各半，購自上海杰思捷實驗動物有限公司［許可證號：SCXK（滬）2014-0006］。3只雄性新西蘭大白兔，體質(zhì)量2kg左右，購自上海杰思捷實驗動物有限公司。所有動物嚴(yán)格飼養(yǎng)在CL級動物房內(nèi)，自由進(jìn)食、飲水，12h交替照明。

1.1.2 實驗藥物與試劑 注射用MMF購自重慶萊美藥業(yè)有限公司（批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20059282），每瓶用10mL 生理鹽水溶解，保存于-20 ℃冰箱內(nèi)，用前稀釋到所需濃度即可。大鼠血肌酐、尿素氮檢測試劑盒購自南京建成生物研究所（批號：20130812）；大鼠IL-1和TGF-β1ELISA 試 劑 盒 購 自 武 漢優(yōu)爾生科技股份有限公司（批號：DZP-13611）。

1.1.3 實驗儀器 AU5800型生化分析儀購自美國Beckman Coulter公司；Spectra Max M5多功能酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司；GFM-600熒光倒置顯微鏡、ASP300S 組織脫水機(jī)、VT1200S全自動振動切片機(jī)購自德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 可溶性GBM 抗原的制備 參照造模方法［9］，用20%烏拉坦麻醉SD 大鼠后，正中切開腹部，無菌條件下游離雙腎并剝離腎包膜，取腎皮質(zhì)于冷無菌0.1 mol／L PBS溶液中涮洗。將清洗過的腎皮質(zhì)剪碎并放到60目篩網(wǎng)上小心研磨并用冷PBS沖洗，棄去滯留物并收集濾液。依次將濾液經(jīng)80目和200目篩網(wǎng)過濾，反復(fù)用PBS溶液沖洗，最終收集200目篩網(wǎng)上滯留物。取收集物于PBS溶液中重懸，超聲40min，使腎小球完全破碎，即可得到可溶性GBM。雙縮脲試劑法測量可溶性GBM 抗原溶液的總蛋白濃度，調(diào)整濃度為20mg／mL，-20℃保存，待用。

1.2.2 兔抗SD 大鼠GBM 抗體血清的制備 取制備好的GBM 抗原溶液0.5mL，加入等體積的完全弗氏佐劑，渦旋振蕩器上充分乳化。取乳化后的乳濁液于新西蘭兔背部進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射，首次免疫當(dāng)天記為第0天。在免疫后第15天進(jìn)行二次免疫。在免疫后第35 天，經(jīng)耳緣靜脈注射20 mg／mL SD 大鼠GBM 抗原溶液0.1mL，再一次加強(qiáng)免疫。7d后取血檢測兔抗SD 大鼠GBM 抗體的效價，效價合適后即可從兔頸總動脈取血，收集兔血清并56 ℃滅活補(bǔ)體30min，-80 ℃保存，待用。

1.2.3 SD 大鼠抗GBM 腎炎模型的建立 實驗分為空白對照組、模型對照組和MMF 治療組，每組10只健康SD 大鼠。實驗開始前，收集全部SD 大鼠的24h尿液，檢測24h尿蛋白的總量，結(jié)果均無異常。取含5mg正常兔IgG 與等體積的完全弗氏佐劑充分乳化，于模型對照組和MMF治療組SD 大鼠背部多點(diǎn)皮下注射乳濁液，進(jìn)行預(yù)免疫。預(yù)免疫5d后，按5 mL／kg劑量的兔抗SD 大鼠GBM 抗體血清經(jīng)尾靜脈注射到模型對照組和MMF治療組SD 大鼠體內(nèi)，建立SD 大鼠抗GBM腎炎模型。建模1周后，MMF治療組每天以500mg／kg劑量腹腔注射MMF 1.0mL，同時空白對照組和模型對照組每天腹腔注射生理鹽水10mL。

1.2.4 血清及尿液生化指標(biāo)的測定 分別于給藥第0、1、2、3和4周收集實驗動物血液和尿液樣本。用20%烏拉坦麻醉動物，眼眶后靜脈叢取血，收集血清分裝于EP管中，-80℃冰箱內(nèi)保存，待測。采用小鼠代謝籠收集各組動物24h尿液，低溫保存。生化分析儀檢測各組動物24h尿蛋白、血尿素氮和血肌酐的水平，ELISA 試劑盒檢測各組動物外周血中IL-1 和TGF-β1的水平。

1.2.5 腎臟組織病理分析 經(jīng)MMF 給藥治療4周后，各組動物脫頸椎處死，立即取出雙側(cè)腎臟，剝離腎包膜，固定于4%甲醛溶液中，48h后脫水、石蠟包埋，5μm 切片。石蠟切片進(jìn)行HE染色和碘酸雪夫氏（PAS）染色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組的組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 治療前后各組24h尿蛋白排泄量的比較 與空白對照組比較，在注射兔抗SD 大鼠GBM 抗體血清7d后，模型對照組和MMF治療組動物的24h尿蛋白排泄量顯著性升高（P＜0.05），提示造模成功。而模型對照組和MMF 治療組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)MMF 治療1 周，MMF 治療組24h尿蛋白的排泄量就開始下降，提示腎功能開始得到改善；MMF治療4周后，相較于同期的模型對照組，治療組SD大鼠的24h尿蛋白的排泄量明顯下降，見表1。

表1 不同治療時間點(diǎn)各組24h尿蛋白的排泄量（±s，mg／d）

表1 不同治療時間點(diǎn)各組24h尿蛋白的排泄量（±s，mg／d）

a：P＜0.01，與空白對照組比較；b：P＜0.05，c：P＜0.01，與模型對照組比較。

組別 第0周 第1周 第2周 第3周 第4周空白對照組 7.31±1.06 8.25±1.13 7.54±1.07 7.03±1.26 6.87±0.98模型對照組 78.62±9.35a 96.33±12.74a 109.76±17.43a 113.86±20.55a 127.63±24.48a MMF治療組 80.33±11.53 85.54±12.67b 72.62±8.51c 58.83±5.29c 51.73±6.37 c

表2 不同治療時間點(diǎn)各組血肌酐水平比較（±s，μmol／L）

表2 不同治療時間點(diǎn)各組血肌酐水平比較（±s，μmol／L）

a：P＜0.01，與空白對照組比較；b：P＜0.05，c：P＜0.01，與模型對照組比較。

組別 第0周 第1周 第2周 第3周 第4周空白對照組 58.43±3.71 60.74±6.52 57.48±2.79 58.29±3.11 57.36±4.54模型對照組 97.25±8.66a 122.39±15.46a 151.76±20.84a 166.92±23.81a 185.72±22.46a MMF治療組 105.58±17.49a 112.46±14.73a 128.76±16.33ab 141.78±17.29ab 155.37±16.83 ac

表3 不同治療時間點(diǎn)各組血尿素氮水平比較（±s，mmol／L）

表3 不同治療時間點(diǎn)各組血尿素氮水平比較（±s，mmol／L）

a：P＜0.01，與空白對照組比較；b：P＜0.05，c：P＜0.01，與模型對照組比較。

組別 第0周 第1周 第2周 第3周 第4周空白對照組 8.63±0.72 8.04±0.83 7.29±0.54 6.89±0.67 6.9 1±0.71模型對照組 12.57±3.68a 12.39±2.86a 13.10±3.51a 12.95±3.06a 13.48±3.04a MMF組 12.26±3.37 11.75±2.86 11.36±2.84ab 10.78±2.51ab 9.48±1.65 ac

2.2 治療前后各組血肌酐、尿素氮的比較 在造摸前，各組動物外周血中血肌酐、尿素氮的水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。注射兔抗SD 大鼠GBM 抗體后1周，相較于空白對照組，模型對照組和MMF治療組動物的血肌酐、尿素氮的水平顯著升高（P＜0.05）。隨著MMF 腹腔注射治療后，外周血中血肌酐、尿素氮的水平相較同期模型對照組開始下降，提示腎臟的損傷程度開始得到緩解；經(jīng)過4 周的治療后，MMF 治療組SD 大鼠的血肌酐、尿素氮顯著下降，與同期模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），較空白對照組有輕度增加。見表2、3。

2.3 治療前后各組動物外周血中IL-1及TGF-β1的比較 本研究采用ELISA 試劑盒測定各組動物外周血中IL-1和TGFβ1的水平。結(jié)果表明，注射兔抗SD 大鼠GBM 抗體血清1周之后，模型對照組和MMF治療組動物IL-1和TGF-β1的水平均較空白對照組有顯著性的上升（P＜0.05），模型對照組和MMF治療組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。MMF 治療4周后，MMF治療組動物外周血中IL-1和TGF-β1的水平均顯著性低于模型對照組。見表4。

表4 治療前后各組動物外周血中IL-1和TGF-β1 水平比較（±s，ng／mL）

表4 治療前后各組動物外周血中IL-1和TGF-β1 水平比較（±s，ng／mL）

a：P＜0.01，與空白對照組比較；b：P＜0.01，與模型對照組比較。

組別IL-1第0周 第4周TGF-β 1第0周 第4周空白對照組0.37±0.025 0.35±0.039 4.18±1.06 4.77±1.35模型對照組 4.68±0.27a 5.29±0.48a 7.81±1.66a 9.52±2.13a MMF治療組 4.81±0.35a 3.13±0.17ab 7.92±1.58a 5.36±1.48 ab

2.4 腎臟組織石蠟切片HE 染色和PAS染色顯微鏡觀察 HE和PAS染色表明，模型對照組腎小球系膜細(xì)胞增生，形態(tài)破壞嚴(yán)重；有大量炎性細(xì)胞浸潤到腎小球內(nèi)以及周圍間質(zhì)區(qū)；腎小球有新月體形成。經(jīng)過MMF治療后，造摸動物腎小球的整體病理變化得到改善，腎小球及其周圍間質(zhì)區(qū)炎性細(xì)胞浸潤減少；腎小球和腎小管的變性得到改善；新月體數(shù)量明顯下降。見圖1。

圖1 各組動物腎組織HE和PAS染色結(jié)果（×400）

3 討 論

人類新月體腎病和Goodpasture綜合征等皆屬于抗GBM相關(guān)疾?。?0］，該病是由于機(jī)體對Ⅳ型膠原α3鏈的非膠原區(qū)耐受性失調(diào)，產(chǎn)生自身抗體，而造成多器官損傷的一類自身免疫疾病，多見于男性［11-12］。常累及腎臟，即為新月體腎小球腎炎，臨床表現(xiàn)為血尿、蛋白尿，患者腎功能下降迅速，如不及時治療，幾周內(nèi)即可進(jìn)展至腎衰竭。目前該病的治療手段主要包括血漿置換以及糖皮質(zhì)類激素聯(lián)合免疫抑制劑等強(qiáng)化治療。

本研究參考Bhan等造模方法，先使用正常兔IgG 聯(lián)合完全弗氏佐劑對造模SD 大鼠進(jìn)行預(yù)免疫，5d后經(jīng)尾靜脈注射兔抗SD 大鼠GBM 抗體血清，1周后發(fā)現(xiàn)造模大鼠24h尿蛋白以及外周血尿素氮和血肌酐明顯著性高于空白對照組大鼠，并維持在較高水平，與免疫相關(guān)的細(xì)胞因子如IL-1和TGF-β1也明顯提高，提示成功建立SD 大鼠抗GBM 腎炎模型。

MMF是一種新型免疫抑制劑，口服吸收完全，利用度高，在體內(nèi)可迅速分解為活性成分MPA。MMF耐受性好，無肝、腎毒性，不會引起骨質(zhì)疏松、高血壓等不良反應(yīng)，骨髓抑制作用也大大弱于其他類非選擇性免疫抑制劑。目前，MMF在器官移植、自身免疫疾病等疾病的治療上應(yīng)用較多［13-14］。

本研究使用MMF治療抗GBM 腎炎SD 大鼠1周后，24h尿蛋白的排泄量就開始下降，指示腎功能開始得到改善；治療4周后，相較于同期的模型對照組，治療組SD 大鼠的24h尿蛋白的排泄量顯著性下降，外周血尿素氮、血肌酐以及與免疫相關(guān)的細(xì)胞因子IL-1和TGF-β1的水平也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于模型對照組。經(jīng)過MMF治療后，抗GBM 腎炎大鼠的腎小球及其周圍間質(zhì)區(qū)炎性細(xì)胞浸潤減少，新月體數(shù)量明顯下降，提示腎小球的整體病理變化得到改善。

綜上所述，本研究通過對腎功能和免疫等相關(guān)指標(biāo)的考察，證明了MMF治療SD 大鼠抗GBM 腎炎疾病的療效確切，為其在臨床上治療人類相關(guān)疾病的應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。

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