培哚普利下調(diào)糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)清道夫受體A 表達

曾映娟，孫 瑩，文江華，胡 芳，羅順葵，魯紅云

（中山大學附屬第五醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東珠海519000）

清道夫受體A（scavenger receptor A，SR-A）是一種跨膜糖蛋白受體，參與氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）和高級糖基化終產(chǎn)物（AGEs）的攝取并且在調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)、細胞黏附、細胞凋亡等生理病理過程中起著重要作用。最近發(fā)現(xiàn)敲除SR-A 基因的小鼠對鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病腎損害具有抵抗性，其24h尿清蛋白、腎小管間質(zhì)損傷、浸潤的巨噬細胞數(shù)目及轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）的表達等均較同系野生型糖尿病小鼠明顯減少，提示SR-A 是糖尿病腎病小管間質(zhì)纖維化的危險因素之一。大量的研究證實血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）能延緩糖尿病腎病小管間質(zhì)纖維化發(fā)展，但是否會對SR-A 的表達產(chǎn)生一定的作用目前尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 動物與材料 實驗動物購自中山大學實驗動物中心，STZ購自美國Sigma公司，培哚普利購自法國施維雅公司，大鼠尿清蛋白檢測試劑盒購自美國Bethyl公司，羊抗鼠SR-A 多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，免疫組織化學SP（法）試劑盒、DAB顯色試劑盒、Masson三色染色試劑盒購自福州邁新公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型的建立 用隨機數(shù)字表將大鼠分為健康對照組（n＝9），糖尿病組（n＝9）和培哚普利干預(yù)組（n＝9）。糖尿病組與培哚普利干預(yù)組大鼠給予STZ（溶于0.1 mol／L、pH4.2的枸櫞酸緩沖液）60mg／kg一次性腹腔注射，72h測血糖大于16.7mmol／L為模型制作成功；健康對照組給予等量的枸櫞酸緩沖液一次性腹腔注射。培哚普利干預(yù)組給予培哚普利4mg·kg-1·d-1灌胃，健康對照組和糖尿病組給予等量飲用水。整個實驗期間動物喂標準飼料，自由飲水，共觀察24周。

1.2.2 一般生化指標和標本收集 每4周將大鼠放入代謝籠內(nèi)留取24h尿液，記錄尿量，按試劑盒書說明測定尿清蛋白，并檢測每只大鼠的隨機血糖和體質(zhì)量；第24周測量體質(zhì)量后處死大鼠，取出腎臟，計算腎臟質(zhì)量／體質(zhì)量比值。收集腎臟標本進行相關(guān)實驗。

1.2.3 Masson染色 石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，Masson復(fù)合染色液染色，磷鉬酸溶液染色，苯胺藍染色，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。結(jié)果判定：每張切片隨機選擇10個視野，觀察腎小管間質(zhì)的病理變化，進行量化評分，0分：正常；1分：間質(zhì)纖維化、炎癥細胞浸潤、腎小管萎縮、水腫、變性及小管管型等病變范圍小于25%；2分：病變范圍25%～＜50%；3分：病變范圍≥50%；最后以平均值來表示該標本腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)［1］。

1.2.4 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測SR-A mRNA 的表達 按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，cDNA 的合成參照cDNA 第一鏈合成試劑盒說明操作，RT-PCR 反應(yīng)按照SYBR GreenⅠPCR 試劑盒說明操作。大鼠特異性基因引物由Invitrogen公司合成，SR-A：正向引物5′-ACT TCA GCA TGG CAA CCG AC-3′，反 向 引 物5′-TGG AAA TTG CAT CCA GGG AC-3′，擴增片段長度105bp；內(nèi)參基因采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH），正向引物5′-AGG GCT GCC TTC TCT TGT GA-3′，反向引物5′-AAC TTG CCG TGG GTA GAG TCA-3′，擴增片段長度110bp。反應(yīng)體系50μL，反應(yīng)條件：93℃預(yù)變性3min；93 ℃變性30s，55 ℃退火30s，72 ℃延 伸30 s，40個循環(huán)，每個循環(huán)延伸后收集一次熒光；最后進行熔解曲線分析。陰性對照采用滅菌雙蒸水代替cDNA，采用雙標準曲線法相對定量，以SR-A 與內(nèi)參基因表達量的比值來表示其相對表達水平。每個樣品復(fù)孔3次，取平均值。

1.2.5 免疫組織化學染色 采用Eli Vision法。石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)；3%過氧化氫滅活內(nèi)源性酶；4 ℃過夜孵育一抗（美國Sata Cruz公司羊抗鼠SR-A，1∶200PBS 稀釋）；使用免疫組織化學SP 試劑盒孵育二抗；DAB 溶液顯色，陽性為棕黃色后終止顯色；蘇木素復(fù)染后中性樹脂封片。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，多組資料比較采用單因素方差分析和q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般指標比較 24周實驗結(jié)束時，糖尿病組大鼠死亡1只，健康對照組與培哚普利干預(yù)組無大鼠死亡。糖尿病組大鼠的體質(zhì)量低于健康對照組（P＜0.05），而腎臟質(zhì)量／體質(zhì)量比值、血糖和24h尿清蛋白均高于健康對照組（P＜0.05）；與糖尿病組比較，培哚普利干預(yù)組大鼠的體質(zhì)量、腎臟質(zhì)量／體質(zhì)量比值、血糖差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但24h尿清蛋白明顯降低，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠一般指標比較（±s）

表1 各組大鼠一般指標比較（±s）

a：P＜0.05，與健康對照組比較；b：P＜0.05，與糖尿病組比較。

組別 n 體質(zhì)量（g）腎臟質(zhì)量／體質(zhì)量（mg／g）尿清蛋白（mg／24h）血糖（mmol／L）健康對照組9 624±71 2.62±0.26 2.7±1.3 5.3±0.6糖尿病組 8 324±60a 5.59±0.74a 26.7±1.8a 26.7±3.3a培哚普利干預(yù)組 9 353±47a 5.46±0.81a 3.6±1.4b 26.2±2.0 a

2.2 腎臟的形態(tài)學改變 Masson染色可見健康對照組腎臟無明顯病理改變，糖尿病組大鼠腎小管間質(zhì)有嚴重組織損傷，表現(xiàn)為部分腎小管上皮細胞萎縮、空泡樣變性，間質(zhì)有較多的炎癥細胞浸潤，并出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化，培哚普利干預(yù)組大鼠腎臟的上述病理改變較糖尿病組明顯減輕。量化分析結(jié)果顯示，糖尿病組（1.89±0.23）的腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)顯著高于健康對照組（0.25±0.11）和培哚普利干預(yù)組（0.71±0.12），均P＜0.05。見圖1。

圖1 各組大鼠腎小管間質(zhì)Masson染色（×200）

2.3 培哚普利干預(yù)對腎小管間質(zhì)SR-A mRNA 表達的影響 RT-PCR結(jié)果顯示糖尿病組大鼠腎臟SR-A mRNA 表達水平約為健康對照組的4倍（5.6±1.2vs.1.4±0.1，P＜0.05）；培哚普利干預(yù)組腎臟SR-A mRNA 表達顯著低于糖尿病組（3.4±0.7vs.5.6±1.2，P＜0.05）。見圖2。

2.4 培哚普利干預(yù)組對腎小管間質(zhì)SR-A 蛋白表達的影響 免疫組織化學染色可見健康對照組大鼠腎小管上皮細胞和腎間質(zhì)只有少量棕褐色的陽性著色；糖尿病組腎小管間質(zhì)中陽性著色明顯增多；與糖尿病組比較，培哚普利干預(yù)組的著色范圍明顯減少。見圖3。

圖2 各組大鼠腎臟SR-A mRNA 的相對表達

3 討 論

糖尿病腎病是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，是終末期腎衰竭的最常見病因。研究顯示，腎小管間質(zhì)纖維化幾乎是所有腎臟疾病發(fā)展到終末期腎病的共同通路，腎功能減退與小管間質(zhì)的病變程度的聯(lián)系比腎小球更密切，糖尿病腎病患者的遠期預(yù)后主要取決于小管間質(zhì)病變程度［2］。因此研究糖尿病腎病腎小管間質(zhì)病變的機制，對改善其預(yù)后具有重要意義。

SR-A 是一種細胞表面的跨膜糖蛋白受體，最初從巨噬細胞上發(fā)現(xiàn)。在早期的動脈粥樣硬化的研究中證實，SR-A 主要介導血液中化學修飾的脂質(zhì)如ox-LDL 進入細胞內(nèi)而不受控制最終造成泡沫細胞形成［3］。有研究發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞也存在包括SR-A 在內(nèi)的多種清道夫受體，而且可能與腎小管間質(zhì)的損傷相關(guān)［4］。

許多與糖尿病腎病發(fā)病密切相關(guān)的因素如腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性增加、非酶糖基化作用、氧化應(yīng)激等均可以上調(diào)SR-A 表達。糖尿病腎病早期腎內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）即被激活，局部血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）產(chǎn)生增加，AngⅡ可呈時間和劑量依賴性上調(diào)SR-A，這一作用是通過PKC信號傳導途徑實現(xiàn)的［5］。另外，長期高血糖狀態(tài)加速蛋白質(zhì)發(fā)生非酶促糖基化反應(yīng)，腎組織內(nèi)糖基化終產(chǎn)物（AGEs）蓄積增多，AGEs通過活化酪氨酸蛋白激酶后進一步激活磷脂酶C，最終激活NF-κB，而促進SR-A 的表達［6］。此外，糖尿?。ㄓ绕涫翘悄虿∧I病）患者常伴有脂質(zhì)代謝紊亂，血清中低密度脂蛋白（LDL）水平升高。在糖尿病狀態(tài)下，體內(nèi)氧化應(yīng)激增強，LDL容易被氧化修飾為ox-LDL，ox-LDL與SR-A 的結(jié)合能夠刺激巨噬細胞分泌前炎性因子和生長因子，這些因子反過來又刺激SR-A 的表達［3，7］。本研究中糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)SR-A 基因和蛋白質(zhì)表達升高可能是上述因素共同作用的結(jié)果。

RAS激活在糖尿病腎病腎小管間質(zhì)損害中起著重要作用，但具體機制尚不完全清楚。大量的基礎(chǔ)實驗及臨床研究已證實使用ACEI阻斷血管緊張素系統(tǒng)（RAS）對糖尿病腎病具有保護作用［1，8-12］。ACEI抑制AngⅡ生成，一方面能改善糖尿病腎臟血流動力學異常；另一方面也有降低微炎性反應(yīng)，下調(diào)小管間質(zhì)TGF-β表達，抗腎小管間質(zhì)纖維化的作用［13］。本研究首次觀察了ACEI類藥物培哚普利干預(yù)對STZ誘導的糖尿病大鼠腎臟SR-A 表達的影響，發(fā)現(xiàn)培哚普利干預(yù)24周后，不僅降低24h尿清蛋白，減輕腎小管間質(zhì)的病理學改變及巨噬細胞的浸潤，而且顯著下調(diào)SR-A 表達。但其抑制SR-A 表達的機制尚不清楚，除了減少尿蛋白帶來的腎臟保護效應(yīng)之外，不排除通過其他途徑發(fā)揮作用。糖尿病腎病早期腎內(nèi)RAS即被激活，小管間質(zhì)局部AngⅡ產(chǎn)生增加［14］，而既往研究已在細胞水平上證實，AngⅡ可呈時間和劑量依賴性上調(diào)SR-A［5］，因此，培哚普利下調(diào)SR-A 表達的作用，可能與其阻斷糖尿病腎組織局部的RAS活性，抑制AngⅡ生成過多有關(guān)，但其確切機制有待進一步研究。

總之，本研究觀察到糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)SR-A 表達增加，ACEI類藥物培哚普利可減少SR-A 的表達，改善糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)損傷。

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