綠原酸調(diào)節(jié)肥胖大鼠胰島素抵抗作用的研究＊

楊 輝，周遠(yuǎn)大，何海霞

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.藥學(xué)部；2.臨床藥理研究室 400016）

胰島素抵抗（IR）在2型糖尿病和心血管病的發(fā)病機制中起到重要作用，改善IR 是2型糖尿病患者治療的一個主要目標(biāo)［1］。肥胖和缺乏鍛煉是IR 的主要原因，減體質(zhì)量和生活方式改變是IR 治療的基石和最有效的治療方法［2］。現(xiàn)有的針對IR 的藥物如二甲雙胍、噻唑烷二酮類，并不能保持血糖在正常范圍內(nèi)且有顯著的不良反應(yīng)。從天然藥物中尋找能改善IR 的藥物，逐漸成為研究重點。新近研究發(fā)現(xiàn)，中藥金銀花在抗氧化、降脂降糖［3-5］方面有獨到之處，而金銀花中最重要的活性物質(zhì)是3-O-咖啡?？崴?，簡稱綠原酸（chlorogenieacids，CHA）。本實驗擬采用飼喂高脂飼料的方法建立肥胖大鼠IR模型，從生理生化等多方面觀察CHA 的作用，旨在為研究CHA 改善IR 作用及其機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級SD 大鼠，雄性，5～6周齡，體質(zhì)量160～180g，購于重慶醫(yī)科大學(xué)試驗動物中心［動物生產(chǎn)許可證號：SCXF（渝）2007-0001］。大鼠由專人標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)房飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度保持25 ℃左右，濕度50%左右，明暗周期12h，自由飲水和進(jìn)食（飼以普通飼料）。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行分組飼養(yǎng)。

1.2 材料與試劑 大鼠基礎(chǔ)飼料由重慶醫(yī)科大學(xué)試驗動物中心提供；高脂飼料由課題組自制：即在基礎(chǔ)飼料中添加10%的蔗糖、2.5%的膽固醇、12%的熟豬油、1%的膽酸鹽，總熱量為3.867kcal／g，金銀花提取物（含98.19% CHA）購自西安開來生物工程有限公司，批號K130224；吡格列酮購自北京太洋藥業(yè)有限公司，批號120902。膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、游離脂肪酸（FFA）、肌糖原及肝糖原測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供；胰島素放射免疫試劑盒由北京北方生物技術(shù)研究所提供。

1.3 方法

1.3.1 營養(yǎng)型肥胖大鼠IR 模型的建立及實驗分組 健康大鼠喂以高脂飼料。飼喂6周后，測定大鼠體質(zhì)量、體長和口服糖耐量。以體質(zhì)量超過正常組大鼠20%，Lee′s指數(shù)增加且口服糖耐量測試（OGTT）降低作為模型成功的標(biāo)志［6］，未達(dá)標(biāo)大鼠棄用。以健康大鼠（喂以基礎(chǔ)飼料）為空白組，造模成功的大鼠分為模型組、吡格列酮組、CHA 大劑量組、CHA 小劑量組，每組10只。每天上午，CHA 大、小劑量組分別灌服60mg／kg和30mg／kg CHA，吡格列酮組灌服吡格列酮4.5 mg／kg［7-8］（CHA 和吡格列酮均以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配置，現(xiàn)配現(xiàn)用），模型組和空白組灌服羧甲基纖維素鈉溶液，各組動物給藥容量均為0.5mL／100g。除空白組每天按常規(guī)給予基礎(chǔ)飼料外，其余實驗組給予高脂飼料。實驗期間觀察大鼠攝食量、飲水量、活動及死亡情況，每周稱體質(zhì)量，連續(xù)喂養(yǎng)4周。

1.3.2 Lee′s指數(shù)、OGTT 的測定 測定各組大鼠體質(zhì)量和體長，計算Lee′s指數(shù)，Lee′s指數(shù)＝體質(zhì)量（g）×1／3×1 000／體長（cm）。OGTT 方法為大鼠禁食過夜，以葡萄糖水2g／kg灌胃，在0、30、60、120min分別測定血糖，計算血糖曲線下面積（AUC）［9］。

1.3.3 生化指標(biāo)的測定 用水合氯醛麻醉大鼠，頸動脈插管取血，3 500r／min離心，分離血清，-20 ℃保存待測。用全自動生化分析儀測定大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平，用SOD 和MDA 測試盒測定肝臟組織中SOD 活力和MDA 水平，采用FFA 測試盒測定血清中FFA，大鼠肝糖原、肌糖原的測定用肌糖原及肝糖原測定試劑盒，血清胰島素水平采用放射免疫方法測定。

1.3.4 臟器系數(shù)及體脂比的測定 采血結(jié)束后，大鼠斷頭處死后解剖，取肝臟、腎臟、胰腺和生殖器周圍、腎周及腸系膜脂肪，用生理鹽水漂凈，用濾紙濾干后稱質(zhì)量，計算臟器系數(shù)及體脂比。

1.3.5 胰島素敏感指數(shù)（HOMA-ISI）及胰島抵抗指數(shù)（HOMA-IR）的測定 取分離后的血清，測空腹胰島素（FINS），再結(jié)合空腹血糖值（FBG），計算HOMA-ISI＝ln［1／（FBG×FINS）］及HOMA-IR＝（FBG×FINS）／22.5［10］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量數(shù)據(jù)用±s表示，組間均數(shù)比較用單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CHA 對肥胖大鼠體質(zhì)量及Lee′s指數(shù)的影響 由表1可知，造模成功后，模型組，CHA 大、小劑量組，吡格列酮組大鼠體質(zhì)量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但顯著高于空白組（P＜0.01）。給予藥物干預(yù)4 周后，CHA 大劑量組大鼠體質(zhì)量增長幅度減緩，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而吡格列酮組大鼠體質(zhì)量增長幅度與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 CHA 對肥胖大鼠臟器系數(shù)及Lee′s指數(shù)的影響 由表2可知，與模型組比較，CHA 大劑量組的肝臟系數(shù)、腎臟系數(shù)和體脂比均有下降的趨勢，尤其是肝臟系數(shù)和體脂比（P＜0.01）；而吡格列酮組大鼠的肝臟系數(shù)、腎臟系數(shù)和體脂比與模型組比較沒有顯著變化（P＞0.05）。造模成功后，模型組，CHA 大、小劑量組，吡格列酮組大鼠的Lee′s指數(shù)顯著高于空白組（P＜0.01）。給予藥物干預(yù)4 周后，CHA 大、小劑量組Lee′s指數(shù)顯著下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05、P＜0.01）。而吡格列酮組大鼠Lee′s指數(shù)與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 CHA 對肥胖大鼠糖耐量的影響 第6周末，從表3中可知，與空白組比較，高脂飼料各組大鼠的1.0h血糖值顯著增加（P＜0.01），其余各時間點血糖差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；高脂飼料各組的AUC 顯著增加（P＜0.05），提示肥胖大鼠的糖耐量降低。第10周末（數(shù)據(jù)未列出），與空白組大鼠比較，模型組0.5、1.0和2.0h的血糖值顯著增加（P＜0.01），AUC顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，CHA 大、小劑量和吡格列酮能夠明顯降低大鼠口服葡萄糖1.0、2.0h后的血糖水平和AUC（P＜0.01）。表明CHA 和吡格列酮能顯著改善糖耐量。

表1 CHA 對肥胖大鼠體質(zhì)量的影響（±s，g）

a：P＜0.05、b：P＜0.01，與空白組比較；c：P＜0.05、d：P＜0.01，與模型組比較。

組別 6周 7周 8周 9周 10周空白組 292±52d 327±47d 369±50d 387±51d 405±38 d模型組 402±30b 451±43b 473±43b 491±51b 504±42b CHA大劑量組 400±35b 414±28bc 439±27bc 444±34bc 457±27bd CHA小劑量組 403±41b 432±32b 450±32b 468±42b 484±46b吡格列酮組 401±31b 449±37b 471±38b 485±22b 496±26 b

2.4 CHA 對肥胖大鼠肝糖原、肌糖原、血清胰島素及抗氧化指標(biāo)的影響 由表4可知，與空白組大鼠比較，模型組，CHA大、小劑量組，吡格列酮組肝糖原和肌糖原水平顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，吡格列酮組和CHA 大、小劑量組大鼠肝糖原和肌糖原水平均顯著升高（P＜0.01）。模型組大鼠血清胰島素水平較正常組比較顯著上升（P＜0.01），出現(xiàn)高胰島素血癥，表明產(chǎn)生了IR。給予藥物干預(yù)后，與模型組比較，CHA 大、小劑量組和吡格列酮組大鼠胰島素水平顯著下降（P＜0.01）。表明CHA 和吡格列酮可改善肥胖大鼠的高胰島素血癥。由表4可知，與空白組比較，模型組大鼠肝臟SOD 水平下降，MDA 水平增加；與模型組比較，CHA 大、小劑量組，吡格列酮組大鼠肝臟SOD 水平升高，MDA 水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。

表2 CHA 對肥胖大鼠臟器系數(shù)、體脂比及Lee′s指數(shù)的影響（±s）

表2 CHA 對肥胖大鼠臟器系數(shù)、體脂比及Lee′s指數(shù)的影響（±s）

a：P＜0.05、b：P＜0.01，與空白組比較；c：P＜0.05、d：P＜0.01，與模型組比較。

組別 腎臟系數(shù) 肝臟系數(shù) 胰系數(shù) 體脂比 Lee′s指數(shù)（6周） Lee′s指數(shù)（10周）空白組 0.61±0.06d 2.52±0.25d 0.17±0.02d 2.77±0.28d 305.03±20.76c 289.08±10.39 d模型組 0.74±0.10b 3.15±0.31b 21.00±0.03b 5.19±0.52b 333.35±27.67a 316.97±8.99b CHA 大劑量組 0.66±0.06a 2.63±0.27d 0.19±0.02a 4.08±0.42bd 332.52±20.94b 298.12±10.06d CHA 小劑量組 0.72±0.10b 2.92±0.31b 0.21±0.03b 4.76±0.50b 333.84±26.82a 304.83±13.44bc吡格列酮組 0.75±0.13b 3.14±0.53b 0.22±0.04b 5.24±0.87b 336.75±27.94b 313.17±18.85 b

表3 6周末CHA 對肥胖大鼠糖耐量的影響（±s）

表3 6周末CHA 對肥胖大鼠糖耐量的影響（±s）

a：P＜0.05、b：P＜0.01，與空白組比較。

組別血糖（mmol／L）0min 0.5h 1.0h 2.0h AUC（mm2）空白組 4.37±0.69 6.07±0.69 6.09±0.53 4.30±0.56 10.84±0.99模型組 4.59±0.33 6.15±0.73 7.37±093b 4.64±1.26 12.07±1.29a CHA 大劑量組 4.62±0.39 6.04±0.73 7.46±1.01b 4.59±0.81 12.07±1.01a CHA 小劑量組 4.57±0.34 6.09±0.73 7.38±1.11b 4.71±1.02 12.08±0.85a吡格列酮組 4.79±0.39 6.14±0.82 7.37±1.17b 4.41±0.85 12.00±0.84 a

表4 CHA 對肥胖大鼠肝糖原、肌糖原、血清胰島素及抗氧化指標(biāo)的影響（±s）

表4 CHA 對肥胖大鼠肝糖原、肌糖原、血清胰島素及抗氧化指標(biāo)的影響（±s）

a：P＜0.05、b：P＜0.01，與空白組比較；d：P＜0.01，與模型組比較。

組別 肝糖原（mg／g）肌糖原（mg／g）胰島素（mU／L）SOD活力（U／mgprot）MDA 水平（nmol／mgprot）CAT 活力（U／mL）空白組 11.16±0.78 1.95±0.41 13.81±078 91.10±12.37 3.54±0.87 4.16±1.44模型組 6.19±0.89b 1.25±0.28b 17.49±090b 55.04±7.61b 11.91±3.32b 1.55±0.62b CHA 大劑量組 9.48±1.47bd 1.80±0.34d 12.98±1.47d 88.18±15.16bd 6.27±3.82ad 3.92±0.67d CHA 小劑量組 8.12±0.70bd 1.74±0.29d 13.12±0.70d 70.47±11.31bd 9.10±3.03bd 2.62±1.71a吡格列酮組 9.74±1.40bd 1.81±0.34d 12.74±1.40ad 69.11±12.24bd 6.49±1.54bd 1.83±0.86 d

表5 CHA 對肥胖大鼠血脂水平的影響（±s）

表5 CHA 對肥胖大鼠血脂水平的影響（±s）

a：P＜0.05、b：P＜0.01，與空白組比較；c：P＜0.05、d：P＜0.01，與模型組比較。

組別 TG（mmol／L） TC（mmol／L） HDL-C（mmol／L） LDL-C（mmol／L） FFA（μmol／L）空白組 1.30±0.14 2.05±0.82 1.06±0.11 0.59±0.63 517.15±205.78模型組 2.28±0.69b 5.11±0.98b 0.97±0.13b 2.65±0.84b 1165.95±231.28b CHA 大劑量組 1.29±0.20d 3.76±1.12bd 1.28±0.19ad 1.38±0.93ad 754.13±187.15ad CHA 小劑量組 1.50±0.16ad 4.01±1.11ad 1.15±0.11d 1.28±0.84d 861.56±364.98ac吡格列酮組 1.37±0.10d 2.64±0.57d 1.21±0.11ad 0.70±0.43d 756.76±188.20 ad

2.5 CHA 對肥胖大鼠血脂水平的影響 由表5可知，與空白組比較，模型組大鼠血清TG、TC、HLD 和FFA 水平顯著升高（P＜0.01），HDL水平則顯著降低（P＜0.01）。給予藥物干預(yù)后，CHA 大、小劑量，吡格列酮組TG、TC、HLD 和FFA 水平均有不同程度地降低（P＜0.05或P＜0.01），HDL 水平均有不同程度的升高（P＜0.01）。

2.6 CHA 對肥胖大鼠HOMA-IR和HOMA-ISI影響 由表6可知，實驗結(jié)束時與空白組比較，模型組HOMA-IR 增加，HOMA-ISI下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。CHA 大、小劑量組、吡格列酮組與模型組比較，HOMA-IR 明顯下降，HOMA-ISI增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表6 CHA 對肥胖大鼠HOMA-ISI和HOMA-IR 的影響（±s）

表6 CHA 對肥胖大鼠HOMA-ISI和HOMA-IR 的影響（±s）

b：P＜0.01，與空白組比較；d：P＜0.01，與模型組比較。

組別HOMA-ISI HOMA-IR空白組 -（1.09±0.10）2.87±0.27模型組 -（1.26±0.04）b 3.88±0.51b CHA 大劑量組 -（1.01±0.18）d 2.71±0.25d CHA 小劑量組 -（1.03±0.10）d 2.72±0.24d吡格列酮組 -（0.97±0.14）d 2.72±0.39 d

3 討 論

IR是2型糖尿病和心血管疾病的共同發(fā)病基礎(chǔ)，改善IR是2型糖尿病患者治療的一個主要目標(biāo)。肥胖和缺乏鍛煉是IR的主要原因，減體質(zhì)量和改變生活方式是IR 治療的基石和最有效的治療方法。Lee′s指數(shù)與腹腔脂肪濕質(zhì)量、脂肪細(xì)胞及血脂等指標(biāo)高度相關(guān)，可作為評價成年肥胖模型大鼠肥胖程度的指標(biāo)。肥胖往往伴有體內(nèi)脂肪組織聚集和高脂血癥，特別是血清FFA 的增高在IR 的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用［11-12］。FFA 與IR 互為因果，互相促進(jìn)。肥胖（尤其是腹型肥胖）機體，其脂肪分解活躍，脂肪細(xì)胞的FFA 釋放增多，導(dǎo)致高FFA血癥，進(jìn)而產(chǎn)生IR［13］。本實驗采用高脂飼料喂養(yǎng)6周制備肥胖大鼠IR 模型，再繼續(xù)給予高脂飲食的情況下給予藥物干預(yù)4周，實驗結(jié)果表明CHA 可顯著降低Lee′s指數(shù)、臟器指數(shù)及體脂比，減肥效果優(yōu)于吡格列酮。同時，CHA 可降低高脂誘導(dǎo)的大鼠血清TC、TG、LDL-C、FFA 水平，提高HDL-C 水平，表明CHA 改善胰島素抵抗的作用可能與減體質(zhì)量降脂有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，肥胖與自由基損傷有著密切的關(guān)系［14］。SOD和CAT 是機體自由基清除酶，MDA 是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物。實驗結(jié)果表明CHA 可明顯增加肝臟SOD 水平和血清CAT 水平，降低肝臟中MDA 水平，其中CHA 大劑量組效果最為顯著，表明CHA 改善肥胖大鼠IR 的作用可能與降低氧化應(yīng)激，防止脂質(zhì)過氧化有關(guān)。胰島素調(diào)節(jié)血糖作用的主要靶器官是肝臟、骨骼肌和脂肪組織。IR 狀態(tài)下，內(nèi)源性葡萄糖的增多，肝臟和骨骼肌糖原儲存減少。實驗結(jié)果表明，CHA 能顯著增加糖耐量，降低血清胰島素水平，增加肝糖原、肌糖原的水平，降低HOMA-IR，升高HOMA-ISI。

本研究結(jié)果顯示CHA 具有良好的抑制內(nèi)臟脂肪聚積和改善胰島素抵抗的作用，并能促進(jìn)外周組織吸收利用葡萄糖，降低血清FFA 水平，降低肥胖大鼠的氧化應(yīng)激，防止脂質(zhì)過氧化，其分子機制值得進(jìn)一步研究。

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