強化他汀對大鼠心肌梗死后血小板活化及炎癥的影響＊

唐顯軍，鐘藝華，南映瑜

（重慶市腫瘤研究所內(nèi)科 400030）

血小板的聚集活化及炎癥介質(zhì)的釋放在急性冠狀動脈綜合征（ACS），尤其是它的急性心血管事件心肌梗死中占非常重要的作用。他汀類藥物的常規(guī)應(yīng)用通過降低血脂水平，穩(wěn)定斑塊使這一類人群獲益。近來有研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物的使用可減少靜脈血栓栓塞［1］，而高脂血癥本身并不是靜脈血栓栓塞的危險因素，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)高脂血癥患者循環(huán)血中血小板的活性有明顯的增高，通過他汀降低血小板活性可減少血栓栓塞事件的發(fā)生，此為他汀類藥物多效性中抗血小板機制。炎性反應(yīng)貫穿于動脈粥樣硬化，超敏C-反應(yīng)蛋白（hs-CRP）是肝細(xì)胞分泌的一種急性時相性蛋白，是常見的非特異性促炎介質(zhì)，是急性冠狀動脈綜合征的獨立危險因子［2］。TNF-α是由單核巨噬細(xì)胞分泌的一種促炎介質(zhì)，在調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)中起核心作用。因此，調(diào)節(jié)血清hs-CRP、TNF-α等炎癥介質(zhì)的水平可能是目前治療急性冠脈綜合征的新途徑［3］。他汀類藥物有獨立于降脂作用以外的抗炎作用，即在降脂作用尚未顯現(xiàn)時，他汀類的抗炎效應(yīng)已經(jīng)發(fā)生。故本研究就強化他汀對心肌梗死術(shù)后短期血小板活化及炎癥因子的影響做一初步探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 單克隆抗體FITC-PAC1、PE-CD62p、PerCPCD61及相應(yīng)二抗FITC-IgM，PE-IgG1購自美國BD Pharmingen公司；hs-CRP試劑盒購自美國Beckman公司；TNF-α試劑盒購自美國R＆D 公司。

1.2 用藥及分組 將70只健康雄性SD 大鼠，體質(zhì)量250～300g，分為5組，每組14只，分別為（1）假手術(shù)組（SHAM 組）：開胸后只穿線，不結(jié)扎。（2）心肌梗死對照組：結(jié)扎左冠狀動脈前降支（見后）。（3）常規(guī)劑量組：予以阿托伐他汀10 mg·kg-1·d-1干預(yù)14d后，于第15天造AMI模型。（4）強化他汀組：于造模前12h予以阿托伐他汀50mg／kg灌胃后次日造模。（5）阿托伐他汀常規(guī)小劑量＋術(shù)前強化組（混合劑量組）：予以阿托伐他汀10mg·kg-1·d-1灌胃干預(yù)13d，于第14天（術(shù)前12h）予以阿托伐他汀50mg／kg強化，于第15天造模。以上阿托伐他汀均溶于2mL 蒸餾水中灌胃，假手術(shù)組、心肌梗死對照組術(shù)前給予蒸餾水2mL灌胃。

1.3 心肌梗死大鼠模型的建立 腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg／kg）麻醉，整個胸部祛毛，氣管切開及氣管插管后，左正中旁切開皮膚開胸，結(jié)扎左冠狀動脈前降支。以心電圖肢導(dǎo)聯(lián)ST 段弓背向上抬高持續(xù)0.5h以上作為梗死模型復(fù)制成功的標(biāo)志。

1.4 標(biāo)本采集 分別于造模后24h，予頸靜脈采血法［4］：雙人操作，不麻醉大鼠，手法固定，予小兒頭皮針接2mg·kg-1·d-1空針先用針頭沿胸前正中線約第4肋骨水平右旁開刺入向頸靜脈方向進(jìn)針，接近頸靜脈時，助手輕抽注射器呈負(fù)壓，再以30°～40°角向頸靜脈刺入，有血液自動流入注射器內(nèi)筒，說明針尖已在頸靜脈內(nèi)，此時固定好人鼠，勿使注射器針頭移動，頸靜脈采血1.5mL收集注入非抗凝管中離心取血清凍存測hs-CRP、TNF-α，換針筒后再抽1mL血沿試管壁緩慢注入含0.1 mL的3.8%枸掾酸鈉的試管中，輕輕混勻。從中吸5μL 全血分別加入對照管和實驗管，對照管管中加入FITC-IgM、PEIgG1及PerCP-CD61 單抗各20μL，在實驗管中分別加入FITC-PAC1、PE-CD62p及PerCP-CD61 單抗各20μL。室溫避光放置20min后，用1%PFA 250μL固定10min，1h之內(nèi)完成樣品制備并上機檢測。流式細(xì)胞儀用FACS Calibur（美國BD Pharmingen公司）進(jìn)行測試，激發(fā)光為氬離子激光器，488nm 單譜線，輸出功率為15 mw。對每個實驗樣品檢測10 000個血小板。hs-CRP 采用免疫透射比濁法測定，TNF-α采用酶聯(lián)免疫吸附法測定，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率表示，組間比較采取χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血小板活化標(biāo)志物比較 與SHAM 組比較，心肌梗死對照組術(shù)后24hCD62p和血小板活化因子-1（PAC-1）的表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。強化他汀組血小板活化標(biāo)志物CD62p和血小板活化因子-1（PAC-1）顯著低于心肌梗死對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠術(shù)后24h血小板活化標(biāo)志物CD62p、 PAC-1相對表達(dá)量（±s，%）

表1 各組大鼠術(shù)后24h血小板活化標(biāo)志物CD62p、 PAC-1相對表達(dá)量（±s，%）

a：P＜0.05，與SHAM 組比較；b：P＜0.05，與心肌梗死對照組比較。

組別 n CD62p PAC-1 SHAM 組14 5.78±0.84 11.23±2.45心肌梗死對照組 14 18.23±4.63a 33.12±6.74a強化他汀組 14 10.37±3.27b 19.56±3.26b常規(guī)劑量組 14 14.86±4.31 26.62±4.58混合劑量組14 9.24±3.14 17.84±3.17

2.2 血漿炎癥因子比較 與SHAM 比較，心肌梗死對照組術(shù)后24hTNF-α、和hs-CRP的濃度明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。強化他汀組炎癥因子TNF-α、hs-CRP 的濃度顯著低于心肌梗死對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠術(shù)后24h血漿炎癥因子TNF-α、 hs-CRP濃度（±s）

表2 各組大鼠術(shù)后24h血漿炎癥因子TNF-α、 hs-CRP濃度（±s）

a：P＜0.05，與SHAM 組比較；b：P＜0.05，與心肌梗死對照組比較。

組別 n TNF-α（ng／L） hs-CRP（mg／L）SHAM 組14 102.36±42.79 4.12±0.93心肌梗死對照組 14 277.87±89.31a 10.87±2.15a強化他汀組 14 165.74±53.72b 6.13±1.76b常規(guī)劑量組 14 213.48±78.63 8.91±2.02混合劑量組14 131.19±49.17 5.92±1.39

強化他汀組與混合劑量組相比較，炎癥因子、血小板活化標(biāo)志物水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），常規(guī)劑量組在心肌梗死大鼠術(shù)后與心肌梗死對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、2。

3 討 論

CD62p，PAC-1是血小板活化的表面標(biāo)志物，生理狀況下，血小板不表達(dá)或少量表達(dá)，在病理或物化刺激作用下，血小板活化，血小板膜糖蛋白分子的種類、數(shù)量和構(gòu)型發(fā)生顯著變化，CD62p暴露于血小板膜表面，GPⅡb／Ⅲa在活化時幾乎全部表達(dá)在膜表面［5-6］。CD62p的表達(dá)可以在活化血小板表面持續(xù)下去，并不會被血漿蛋白質(zhì)所掩蓋［7］。CD62p通過介導(dǎo)血小板和血管內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞間的相互黏附，導(dǎo)致細(xì)胞大量聚集，在炎癥和栓塞中起著很重要的作用［8］。

影響血小板活化的因素很多，比如麻醉、手術(shù)，血小板易受到抗凝劑和離體時間的影響，血小板活化后其聚集性會增加，并且會發(fā)生形狀的改變。要避免任何可能導(dǎo)致血小板意外激活的因素，必須盡可能做到順利采集標(biāo)本，及時送檢，改進(jìn)抗凝劑使用方法［9］。本研究采用頸靜脈采血，手法固定，不麻醉大鼠，以及血樣固定后1h內(nèi)上機檢測均為最大程度降低人為的，體外對血小板的活化。PAC-1在血小板表面的表達(dá)量可以精確地反映早期階段血小板的活化［10］，CD62p的升高可作為血栓性疾病病情監(jiān)測和評價血栓前狀態(tài)的有效指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)：心肌梗死對照組與SHAM 組比較，術(shù)后24h血小板活化表面標(biāo)志物PAC-1、CD62p顯著性增高；強化他汀組血小板活化標(biāo)志物顯著低于心肌梗死對照組；強化他汀組與混合劑量組相比較，血小板活化標(biāo)志物水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；常規(guī)劑量他汀在心肌梗死大鼠術(shù)后短期與心肌梗死對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本實驗表明急性心肌梗死術(shù)后血小板發(fā)生顯著活化，而術(shù)前強化他汀可以抑制術(shù)后血小板的這種活化，從而降低進(jìn)一步血栓事件的發(fā)生，而達(dá)到有效保護心肌的目的。而低劑量的他汀藥物持續(xù)給藥在本研究中未觀察到它在急性心肌梗死術(shù)后短期產(chǎn)生的活化抗血小板的有益作用，本研究差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。至于持續(xù)低劑量聯(lián)合術(shù)前一次性負(fù)荷劑量的他汀藥物是否可以在心肌梗死術(shù)后產(chǎn)生比術(shù)前單次負(fù)荷劑量更強的抑制血小板活化作用，本研究只是在實驗結(jié)果中看到這種趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

急性冠狀動脈綜合征的發(fā)生與機體炎性反應(yīng)激活有關(guān)，早期應(yīng)用大劑量阿托伐他汀能快速降低血清炎癥因子水平，從而改善機體的炎癥狀態(tài)，有助于冠狀動脈病變斑塊的穩(wěn)定，從而有可能影響急性冠狀動脈綜合征患者的轉(zhuǎn)歸［11］。有臨床研究顯示強化他汀治療不穩(wěn)定型心絞痛具有較好的臨床效果及安全性，能明顯降低血清hs-CRP、TNF-α水平，具有良好心血管保護作用［12］，急性炎性反應(yīng)在此過程中起了關(guān)鍵性作用。強化他汀緣于它迅速起效的多效性，服用3h 后即可改善內(nèi)皮功能，24h 內(nèi)改善冠狀動脈循環(huán)，降低炎癥因子水平［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死對照組與SHAM 組比較術(shù)后24h急性炎癥因子TNF-α、hs-CRP水平明顯升高，強化他汀組炎癥因子水平顯著低于心肌梗死對照組；強化他汀組與混合劑量組相比較，炎癥因子水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），常規(guī)劑量組在心肌梗死大鼠術(shù)后短期與心肌梗死對照組比較差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明心肌梗死手術(shù)迅速激活大鼠體內(nèi)炎癥介質(zhì)的釋放，而術(shù)前強化他汀可以抑制術(shù)后大鼠體內(nèi)炎癥因子水平，通過改善機體的炎癥狀態(tài)，影響心血管病變的轉(zhuǎn)歸而起到有益作用。而低劑量他汀持續(xù)給藥在本研究中未顯示出他汀多效性的抗炎效應(yīng)。

綜上所述，術(shù)前強化阿托伐他汀能顯著降低心肌梗死大鼠術(shù)后24h急性炎性反應(yīng)，抑制血小板活化，而炎癥和血小板活化的關(guān)系，以及他汀多效性的起效及持續(xù)時間等問題尚需進(jìn)一步研究。

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