葡萄皮渣中原花青素對(duì)臨床常見(jiàn)分離菌的抗菌效應(yīng)分析＊

方 莉，王 靜，許 媛，蔡 燕，廖 濤，唐 中△

（1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川南充637000；2.川北醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，四川南充637000）

原花青素（procyanidins，PC）是植物中廣泛存在的一類(lèi)多酚化合物的總稱(chēng)，由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合而成［1］。原花青素在葡萄籽和松樹(shù)皮中含量較高，能夠有效清除體內(nèi)自由基，具有抗氧化活性、抗輻射、抗癌、減輕過(guò)敏反應(yīng)、改善視力、預(yù)防心腦血管疾病等多種生理活性。單靜敏等［2］研究還顯示原花青素對(duì)細(xì)菌有抑菌和殺菌作用。開(kāi)發(fā)和研制天然植物藥，是目前醫(yī)藥和食品研究中的一個(gè)重點(diǎn)。我國(guó)是葡萄生產(chǎn)大國(guó)，作為PC 的來(lái)源，PC 提取物得到了深入和廣泛的關(guān)注［3］。

大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌是臨床常見(jiàn)的致病革蘭陰性桿菌，金黃色葡萄球菌是臨床上最常分離的致病革蘭陽(yáng)性球菌，由于抗菌藥物的濫用，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Saureus，MRSA）的檢出率不斷上升，MRSA 除對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物在內(nèi)的多種抗菌藥物耐藥外，甚至發(fā)現(xiàn)有對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥的菌株。近年來(lái)，MRSA 以其高致病性和越發(fā)嚴(yán)重的多重耐藥性成為人類(lèi)健康的巨大威脅，已引起廣泛重視［4］。當(dāng)今細(xì)菌耐藥的步伐已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了新藥的研制的速度，及時(shí)準(zhǔn)確地掌握病原菌耐藥性的動(dòng)態(tài)對(duì)指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物、控制和延緩病原菌耐藥性傳播具有重要的意義，本實(shí)驗(yàn)擬了解葡萄皮渣中的PC 對(duì)臨床常見(jiàn)分離菌的抑菌效果，旨在從醫(yī)藥治療感染方面提供新的切入點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 選擇川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科住院患者臨床送檢標(biāo)本中分離的菌株，并經(jīng)梅里埃全自動(dòng)細(xì)菌鑒定分析儀鑒定的大腸桿菌30 株、銅綠假單胞菌28 株、鮑曼不動(dòng)桿菌15株、屎腸球菌32株、糞腸球菌25株、MRSA 70株；質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923。

1.1.2 儀器、試劑及培養(yǎng)基

1.1.2.1 儀器實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ROCHE Lightcycler480Ⅱ）、法國(guó)梅里埃全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀、生物安全柜、電熱恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋。

1.1.2.2 試劑 MRSA 耐藥基因檢測(cè)試劑盒、梅里埃GP、GN 細(xì)菌鑒定卡、GPS藥敏卡；PC（用來(lái)源于河北昌黎縣鳳凰酒莊的釀酒葡萄皮渣提取，采用60%乙醇溶劑浸提法提取，紫外分光光度計(jì)測(cè)定、pH 值示差法計(jì)算提取率，DA-201型大孔吸附樹(shù)脂純化）；二甲基亞砜（DMSO）；MH 瓊脂（杭州天和生物制劑有限公司）；血平板（重慶龐通公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌株最低抑菌濃度（MIC）值的測(cè)定

1.2.1.1 菌液制備 將待測(cè)細(xì)菌接種于血平板上，置電熱恒溫培養(yǎng)箱中（35±1）℃培養(yǎng)18～24h，次日挑取單菌落用生理鹽水將各株細(xì)菌濃度調(diào)整為0.5 麥?zhǔn)蠁挝唬s1×108CFU／mL）。

1.2.1.2 PC的稀釋將PC用DMSO配制成濃度為160、140、120、100、80、60mg／mL 梯度，實(shí)驗(yàn)時(shí)各終濃度分別為8、7、6、5、4、3mg／mL。

1.2.1.3 培養(yǎng)基制備 將已稀釋的不同濃度的PC 按1∶20分別加入經(jīng)高壓滅菌并在45～50 ℃水浴中平衡的MH 瓊脂中，充分混勻傾倒滅菌平皿，瓊脂厚度約4mm，PC的最終濃度分別為3、4、5、6、7、8mg／mL。再制備不含PC與DMSO，以及僅含DMSO 的MH 瓊脂平板接種細(xì)菌作陽(yáng)性對(duì)照，不含藥也不接種細(xì)菌的MH 瓊脂平板作陰性對(duì)照。

1.2.1.4 接種方法 將濃度為0.5 麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，?∶10稀釋?zhuān)∠♂尯蟮木鷳乙杭s2μL接種于含藥和不含藥的MH 瓊脂平板表面，直徑為5～8mm 的菌斑。

1.2.1.5 培養(yǎng)細(xì)菌及觀察 將接種好的平板置于（35±1）℃培養(yǎng)24h，MIC即為肉眼觀察在平板表面的細(xì)菌生長(zhǎng)完全被抑制時(shí)的最低抗菌藥物濃度。

1.2.2 PCR法檢測(cè)MRSA 的mecA基因及nuc基因?qū)?jīng)梅里埃全自動(dòng)細(xì)菌鑒定分析儀鑒定的70株MRSA，按照上海之江生物科技提供的MRSA 耐藥基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。PCR 反應(yīng)條件：37 ℃2min；94 ℃2min；94 ℃15s，60℃60s，40個(gè)循環(huán)；單點(diǎn)檢測(cè)熒光在60 ℃。熒光通道檢測(cè)選擇FAM 通道和HEX 通道。結(jié)果判斷：mecA基因、nuc基因檢測(cè)同時(shí)為陽(yáng)性，判斷為MRSA；mecA基因陰性、nuc基因陽(yáng)性，判斷為甲氧西林敏感型金黃色葡萄球菌（MSSA）；mecA基因陽(yáng)性、nuc基因陰性，判斷為耐甲氧西林菌株（非金黃色葡萄球菌）。

1.2.3 MRSA 對(duì)16種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn) 對(duì)經(jīng)鑒定的70株MRSA 配制成0.5麥?zhǔn)蠁挝坏臐舛?，按法?guó)梅里埃藥敏鑒定方法利用GPS藥敏卡在梅里埃全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀作葡萄球菌的藥敏分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件分析試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PC對(duì)革蘭陰性菌的抑菌作用 用濃度分別為3、4、5、6、7、8mg／mL的PC 處理后，30株大腸桿菌、28株銅綠假單胞菌、15株鮑曼不動(dòng)桿菌的生長(zhǎng)均未受到抑制，3～8mg／mL 的PC對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌無(wú)抑菌作用。

2.2 PC對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的抑菌作用

2.2.1 PC對(duì)腸球菌的抗菌效應(yīng) 32株屎腸球菌在PC 3mg／mL濃度中全部生長(zhǎng)，無(wú)抑菌效果；在濃度為4～8mg／mL PC的培養(yǎng)基中有2株屎腸球菌的生長(zhǎng)被完全抑制，此濃度下對(duì)屎腸球菌的抑菌率為6.3%。25株糞腸球菌在3～8mg／mL 的PC中全部生長(zhǎng)，PC對(duì)糞腸球菌無(wú)抑菌作用。

2.2.2 PC對(duì)MRSA 的抗菌效應(yīng)

2.2.2.1 實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)臨床分離的MRSA 菌株 PCR檢測(cè)臨床分離的70株MRSA 菌株，檢測(cè)結(jié)果顯示mecA基因、nuc基因均為陽(yáng)性。說(shuō)明梅里埃細(xì)菌鑒定分析儀與實(shí)時(shí)熒光PCR 法檢測(cè)MRSA 菌株的結(jié)果符合率為100%，見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR 法檢測(cè)70株MRSA 菌株中mecA 基因、nuc基因的檢測(cè)結(jié)果

2.2.2.2 MRSA 對(duì)16種抗菌藥物的耐藥情況 70株MRSA對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物苯唑西林、芐青霉素的耐藥率為100%；對(duì)喹諾酮類(lèi)環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星，林可酰胺類(lèi)克林霉素，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)紅霉素，氨基糖苷類(lèi)慶大霉素、四環(huán)素、利福平耐藥率均大于60%；而對(duì)甘氨酰環(huán)素類(lèi)替加環(huán)素、人工合成的唑烷酮類(lèi)利奈唑胺，鏈陽(yáng)菌素類(lèi)喹奴普汀／達(dá)福普汀和萬(wàn)古霉素全部敏感，見(jiàn)表2。

表2 70株MRSA 對(duì)16種抗菌藥物的耐藥情況

表3 PC對(duì)MRSA 的抑菌率

2.2.2.3 PC對(duì)MRSA 的抗菌效應(yīng) 濃度為3～8mg／mL 的PC 對(duì)70株MRSA 菌株的抑菌效果見(jiàn)表3。其中67株MRSA的MIC值為4～8mg／mL，MIC50為4.221mg／mL、MIC90為6.260mg／mL。MRSA 在陰、陽(yáng)性對(duì)照平板及PC 中生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖1。

圖1 各組平板MRSA 的生長(zhǎng)情況

3 討 論

本研究顯示，葡萄皮渣中PC對(duì)常見(jiàn)革蘭陰性桿菌如大腸桿菌、銅綠假單胞菌及鮑曼不動(dòng)桿菌無(wú)抑菌作用，當(dāng)PC 濃度達(dá)8mg／mL時(shí)，其生長(zhǎng)率均為100%；對(duì)革蘭陽(yáng)性球菌如MRSA、腸球菌有一定的抑菌效果，特別是對(duì)MRSA 抑菌作用明顯，當(dāng)PC濃度為4mg／mL 時(shí)，MRSA的抑菌率為65.7%，5 mg／mL抑菌率為75.7%，6 mg／mL 抑菌率為87.1%，7mg／mL抑菌率為90.0%，8mg／mL 抑菌率為95.7%。分析70株MRSA 對(duì)16 種抗菌藥物的藥物敏感情況顯示：MRSA除了對(duì)所有β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物耐藥外，對(duì)喹諾酮類(lèi)、林可酰胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)抗菌藥物耐藥率明顯高于其他抗菌藥物；對(duì)甘氨酰環(huán)素類(lèi)、人工合成的唑烷酮類(lèi)、鏈陽(yáng)菌素類(lèi)藥物均敏感，對(duì)廣泛使用的萬(wàn)古霉素也都敏感。但近年來(lái)，我國(guó)MRSA 感染率日漸增加，MRSA 檢出率也逐漸增高。武成彪［5］研究顯示，MRSA 分離率占金黃色葡萄球菌的71.6%。隨著萬(wàn)古霉素的廣泛應(yīng)用，耐萬(wàn)古霉素金黃色葡萄球菌（VRSA）和萬(wàn)古霉素中介金黃色葡萄球菌（VISA）已出現(xiàn)［6］。由于MRSA 的多重耐藥性，對(duì)其用藥的原則應(yīng)根據(jù)臨床結(jié)合藥敏結(jié)果進(jìn)行用藥，謹(jǐn)慎使用頭孢菌素類(lèi)抗菌藥物，盡量不用或少用廣譜抗菌藥物；此外，在積極預(yù)防和控制醫(yī)院感染的同時(shí)，還應(yīng)從其耐藥機(jī)制等多方面研制抗菌藥物，以對(duì)抗萬(wàn)古霉素耐藥的MRSA。

天然植物提取物PC資源豐富，毒副作用輕微，不致癌、無(wú)抗原性，具有抗氧化活性，抗輻射、抗癌、預(yù)防心腦血管疾病等多種生理活性，已被臨床廣泛應(yīng)用并有一定療效。PC 的抗菌機(jī)制仍不十分清楚，有研究表明其對(duì)細(xì)菌的增殖產(chǎn)生抑制作用，其抑制作用可能通過(guò)抑制細(xì)菌代謝所需要的酶類(lèi)，而對(duì)細(xì)菌沒(méi)有直接殺滅作用［7］。PC 中的多酚成分有一定的疏水性，通過(guò)降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性與細(xì)菌的細(xì)胞壁和脂多糖接口進(jìn)行交互，阻止細(xì)胞壁的合成從而殺滅細(xì)菌［8］。有研究通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察到，表面光滑的MRSA 細(xì)胞經(jīng)過(guò)PC 處理后，表面變粗糙，細(xì)胞個(gè)體變腫大，內(nèi)容物相對(duì)減少，說(shuō)明其對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞壁有破壞作用［9］。本研究證實(shí)PC 對(duì)腸球菌有一定藥效，對(duì)MRSA 抑菌效果明顯，而對(duì)革蘭陰性菌無(wú)抑制作用，說(shuō)明PC可作為一種潛在的新藥對(duì)抗革蘭陽(yáng)性球菌。特別是對(duì)MRSA 的明顯抑菌效果，可為臨床治療感染MRSA 患者提供新的方向。本研究?jī)H做了體外藥物抗菌研究，還需進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，關(guān)于其確切機(jī)制有待深入的研究和探討。

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