大豆提取物對(duì)高同型半胱氨酸誘導(dǎo)的家兔動(dòng)脈粥樣硬化病變的影響*

陸紅玲，湯陽(yáng)，黃躍，錢民章，馮贊杰（.遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，貴州遵義56099；.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心胸外科，貴州遵義56099；.遵義醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義56099）

大豆提取物對(duì)高同型半胱氨酸誘導(dǎo)的家兔動(dòng)脈粥樣硬化病變的影響*

陸紅玲1，湯陽(yáng)2，黃躍3，錢民章1，馮贊杰1
（1.遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，貴州遵義563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心胸外科，貴州遵義563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，貴州遵義563099）

摘要：目的探討大豆提取物對(duì)高同型半胱氨酸誘導(dǎo)的家兔動(dòng)脈粥樣硬化（As）病變的防治作用。方法將80只新西蘭家兔隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、大豆提取物預(yù)防組及治療組。除對(duì)照組外，其余各組復(fù)制高同型半胱氨酸誘導(dǎo)的家兔As病變模型，分別于預(yù)防組的0周、治療組的12周開始給予不同劑量大豆提取物（30、60和180 mg/kg）直至24周。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清同型半胱氨酸含量；光學(xué)顯微鏡檢測(cè)主動(dòng)脈壁病理改變。結(jié)果12周后，與對(duì)照組比較，其余各組家兔血清同型半胱氨酸含量明顯升高（P<0.01），并出現(xiàn)不同程度的主動(dòng)脈壁病理改變。與模型組比較，隨著大豆提取物劑量的增加，血清同型半胱氨酸含量呈逐漸下降趨勢(shì)（P< 0.05），同時(shí)家兔主動(dòng)脈血管壁病理變化得到改善。結(jié)論高同型半胱氨酸可以誘導(dǎo)家兔形成As病變。大豆提取物可減少家兔血清同型半胱氨酸含量，并減輕主動(dòng)脈壁As病變的形成。

關(guān)鍵詞：同型半胱氨酸；動(dòng)脈粥樣硬化；病變；大豆提取物

高同型半胱氨酸可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞[1]及平滑肌細(xì)胞損傷[2]，增加血小板黏附，干擾內(nèi)皮纖溶活性，致血管內(nèi)皮功能異常[3]，人們患血栓性相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加[4]。隨著同型半胱氨酸研究的深入，其對(duì)人體健康的影響已越來(lái)越受到人們重視。研究表明，食用富含大豆成分的飲食能有效降低心血管疾病的發(fā)病率[5]。目前，關(guān)于大豆提取物防止高脂誘導(dǎo)的動(dòng)物動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）病變形成的研究報(bào)道較多[6-8]，但關(guān)于其對(duì)高同型半胱氨酸誘導(dǎo)的As病變是否有影響，報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)以新西蘭家兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以同型半胱氨酸誘導(dǎo)家兔產(chǎn)生As病變，觀察大豆提取物對(duì)其病變形成的影響作用。

1　材料與方法

1.1主要試劑及藥品

L-甲硫氨酸（北京索萊寶有限公司），大豆提取物（西安合健生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：1111082，有效成分為26.65%，其中大豆甙14.16%，黃豆黃甙11.48%，染料木素0.65%，大豆甙元0.21%，黃豆黃素0.18%），同型半胱氨酸試劑盒（美國(guó)Sigma公司）。

1.2動(dòng)物和分組

新西蘭家兔80只（重慶市中藥研究院動(dòng)物所，動(dòng)物合格證號(hào)0001386），雌雄不限，體重2.0～2.5 kg，隨機(jī)分為8組（每組10只）：對(duì)照組、模型組、大豆提取物預(yù)防組（低劑量30 mg/kg，中劑量60 mg/kg，高劑量180mg/kg）和大豆提取物治療組（低劑量30mg/kg，中劑量60 mg/kg，高劑量180 mg/kg）。大豆劑量以產(chǎn)品總有效成份計(jì)，低、中、高劑量分別相當(dāng)于人推薦量的5、10和30倍，推薦攝入量為6 mg/（kg·d）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

模型組、預(yù)防組、和治療組每日皮下注射甲硫氨酸80 mg/（kg·d）[9]，對(duì)照組注射同等劑量生理鹽水，持續(xù)注射24周。預(yù)防組自注射甲硫氨酸同時(shí)即飼喂含大豆提取物的飼料，其余各組均飼喂普通飼料。12周后，確認(rèn)兔As模型形成，治療組由普通飼料改喂含大豆提取物的飼料，其余各組不變，繼續(xù)飼喂12周。分別于0、12和24周采集各組家兔耳緣靜脈血，離心收集血清，置入-80℃冰箱保存，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)同型半胱氨酸含量。第24周末，所有家兔用3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，迅速開胸取出主動(dòng)脈至髂動(dòng)脈分叉處和近主動(dòng)脈弓處的血管，置于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋切成4μm厚的切片，HE染色，光鏡觀察各部位動(dòng)脈內(nèi)膜病變。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用雙因素方差分析或單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較用q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1血清同型半胱氨酸含量的檢測(cè)

造模前各組家兔血清同型半胱氨酸水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。造模12周后，與對(duì)照組比較，各組家兔血清同型半胱氨酸含量明顯升高（q12周=35.046、29.538、23.787、20.931、27.093、25.667和26.612，q24周=27.956、22.850、16.875和12.639、20.258、13.959和12.030，P<0.01）；與模型組比較，預(yù)防組隨著大豆提取物劑量的增大，血清同型半胱氨酸含量呈逐漸下降趨勢(shì)（q12周=5.508、11.259和14.116，q24周=5.106、11.082和15.318，P< 0.05），而治療組的血清同型半胱氨酸含量于24周時(shí)開始呈劑量依賴性下降（q12周=2.980、4.406和3.416，q24周=7.396、13.695和15.624，P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2血管病理學(xué)變化

喂養(yǎng)24周后，光學(xué)顯微鏡下觀察顯示，對(duì)照組血管內(nèi)膜光滑完整，平滑肌細(xì)胞排列整齊，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)連續(xù)完整，中層及外膜結(jié)構(gòu)清楚，內(nèi)皮下未見(jiàn)脂質(zhì)及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（見(jiàn)圖1A）；模型組血管壁彌漫性隆起，內(nèi)膜明顯增厚，中層結(jié)構(gòu)紊亂，有內(nèi)皮細(xì)胞壞死脫落，內(nèi)膜中有大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，部分標(biāo)本可見(jiàn)泡沫細(xì)胞，內(nèi)膜下有不規(guī)則平滑肌細(xì)胞增生，膠原纖維和彈性纖維增多（見(jiàn)圖1B、C）；預(yù)防組內(nèi)膜增生程度低于模型組（以高劑量大豆提取物較好），但組內(nèi)差別較大，部分有平滑肌細(xì)胞增生，彈性纖維增多（見(jiàn)圖1D～F）；治療組血管壁也可見(jiàn)部分隆起，突向管腔面，內(nèi)膜增厚，部分有內(nèi)皮細(xì)胞壞死脫落、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，但中膜彈力纖維和膠原纖維形態(tài)較模型組好（見(jiàn)圖1G～I(xiàn)）。檢測(cè)各組家兔胸主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度，與對(duì)照組比較，其他3組內(nèi)膜厚度均明顯增加（P<0.05）；但與模型組比較，隨著大豆提取物劑量增加，內(nèi)膜厚度有減少趨勢(shì)（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.3不同劑量大豆提取物與同型半胱氨酸含量、動(dòng)脈內(nèi)膜厚度的劑量-效應(yīng)關(guān)系

大豆提取物的劑量與家兔體內(nèi)同型半胱氨酸含量、動(dòng)脈內(nèi)膜厚度有相關(guān)性（P<0.05）。見(jiàn)圖2、3。

表1　各組家兔血清同型半胱氨酸水平比較（n=10，20μmol/L±s）

表1　各組家兔血清同型半胱氨酸水平比較（n=10，20μmol/L±s）

注：1）與低劑量預(yù)防組比較，q12周=5.751和8.608，q24周=5.976 和10.212，P<0.01；2）與中劑量預(yù)防組比較，q12周=4.236，P<0.05；3）與低劑量治療組比較，q24周=6.300和8.228，P<0.01；4）與中劑量治療組比較，q24周=2.857，P<0.05

組別　同型半胱氨酸含量0周　12周　24周對(duì)照組　7.29±2.55　7.24±1.87　6.42±2.20模型組　8.53±2.08　26.01±0.73　26.35±2.34 q值（與對(duì)照組比較）　35.046　27.956預(yù)防組低劑量（30 mg/kg）　6.80±2.90　23.06±1.85　22.71±2.08 q值（與對(duì)照組比較）　29.538　22.850 q值（與模型組比較）　5.508　5.106中劑量（60 mg/kg）　7.61±3.17　19.98±1.521）18.45±2.531）q值（與對(duì)照組比較）　23.787　16.875 q值（與模型組比較）　11.259　11.082高劑量（180 mg/kg）　8.09±2.72　18.45±2.141）2）15.43±2.091）q值（與對(duì)照組比較）　20.931　12.639 q值（與模型組比較）　14.116　15.318治療組低劑量（30 mg/kg）　7.76±2.03　24.15±1.35　21.02±2.02 q值（與對(duì)照組比較）　27.093　20.258 q值（與模型組比較）　2.980　7.396中劑量（60 mg/kg）　7.87±1.04　23.26±2.37　16.48±2.353）q值（與對(duì)照組比較）　25.667　13.959 q值（與模型組比較）　4.406　13.695高劑量（180 mg/kg）　6.45±2.71　23.85±2.83 15.09±2.463）4）q值（與對(duì)照組比較）　26.612　12.030 q值（與模型組比較）　3.461　15.624

圖1　各組家兔主動(dòng)脈壁的病理改變

表2　各組家兔胸主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度比較（n=8，μm，±s）

表2　各組家兔胸主動(dòng)脈內(nèi)膜厚度比較（n=8，μm，±s）

組別　動(dòng)脈內(nèi)膜厚度對(duì)照組　71.82±17.53模型組　255.00±11.33 q值（與對(duì)照組比較）　28.033預(yù)防組低劑量（30 mg/kg）　213.99±19.19 q值（與對(duì)照組比較）　21.757 q值（與模型組比較）　6.276

續(xù)表2

圖2　大豆提取物與同型半胱氨酸的量效關(guān)系

圖3　大豆提取物與動(dòng)脈內(nèi)膜厚度的量效關(guān)系

3　討論

同型半胱氨酸主要由蛋氨酸在體內(nèi)代謝形成。越來(lái)越多的證據(jù)表明，高同型半胱氨酸血癥作為一種獨(dú)立危險(xiǎn)因子，可能通過(guò)促氧自由基生成，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞和功能，刺激血管平滑肌細(xì)胞增生，介導(dǎo)動(dòng)脈血管炎癥反應(yīng)等多種機(jī)制誘導(dǎo)As形成[10]。目前，建立高同型半胱氨酸血癥動(dòng)物模型的方法多采用高負(fù)荷甲硫氨酸灌胃、含甲硫氨酸飼料喂養(yǎng)或皮下注射甲硫氨酸。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，皮下注射甲硫氨酸80 mg/（kg·d）持續(xù)12周，可形成穩(wěn)定的高同型半胱氨酸血癥模型。通過(guò)抽檢動(dòng)物標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)12周時(shí)模型組已開始出現(xiàn)As的病理改變。如光鏡下可見(jiàn)血管內(nèi)膜增生，出現(xiàn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，中層結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)膜下有不規(guī)則平滑肌細(xì)胞增生。24周后，HE染色結(jié)果顯示，除對(duì)照組外，其他3組家兔均可見(jiàn)不同程度的主動(dòng)脈壁病理變化，包括內(nèi)膜明顯增厚，平滑肌細(xì)胞增生較為明顯，膠原纖維和彈性纖維增多，部分血管內(nèi)膜下可見(jiàn)泡沫細(xì)胞等，但脂質(zhì)沉積及粥樣斑塊并不明顯，與姜雅秋等[9]的報(bào)道較一致。

大豆被稱為綠色的牛乳，所含的多糖、皂甙及異黃酮類等物質(zhì)具有良好的調(diào)節(jié)血脂[8]、抗氧化[11]、提高機(jī)體免疫等[12]多種生物學(xué)功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，預(yù)防組家兔在皮下注射同型半胱氨酸時(shí)，同時(shí)給予大豆提取物，隨著大豆提取物劑量的增加，血清同型半胱氨酸含量較模型組呈劑量依賴性下降。病理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示預(yù)防組內(nèi)膜增生程度低于模型組，推測(cè)大豆提取物可能通過(guò)抑制體內(nèi)同型半胱氨酸水平的提高，延緩并減輕As病變的發(fā)生與發(fā)展。用高同型半胱氨酸誘導(dǎo)形成As病變后，再給予大豆提取物飼料喂養(yǎng)的家兔實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大豆提取物仍然可以逐步降低體內(nèi)同型半胱氨酸水平，在一定程度上減輕家兔As病變的發(fā)展。只是這種作用較預(yù)防組弱，需要的時(shí)間也更長(zhǎng)，且組內(nèi)動(dòng)物標(biāo)本病理改變差別較大（有20%的血管內(nèi)膜變化與劑量依賴沒(méi)有關(guān)系），推測(cè)對(duì)已形成的As病變，大豆提取物基本不能逆轉(zhuǎn)，而早期病變也許可以改變。

筆者考慮若適當(dāng)加大治療組大豆提取物用量，并延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)周期，也許可以更好地觀察治療效果。另外實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，使用大豆提取物可降低血清同型半胱氨酸含量，推測(cè)與大豆提取物具有抗氧化作用有關(guān)，一方面可減少蛋氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)橥桶腚装彼?，另一方面可促進(jìn)同型半胱氨酸的進(jìn)一步代謝，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的發(fā)生機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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（申海菊編輯）

Effects of soybean extracts on atherosclerotic lesions induced by hyperhomocysteinemia in rabbits*

Hong-ling LU1, Yang TANG2, Yue HUANG3, Min-zhang QIAN1, Zan-jie FENG1
(1. Department of Biochemistry, Zunyi Medical College, Zunyi, Guizhou 563099, P.R. China; 2. Department of Cardiothoracic Surgery, the Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi, Guizhou 563099, P.R. China; 3. Department of Morphological Laboratory, Zunyi Medical College, Zunyi, Guizhou 563099, P.R. China)

Abstract:【Objective】To investigate the effects of soybean extracts on atherosclerotic lesions induced by hyperhomocysteinemia in rabbit.【Methods】First, eighty New Zealand rabbits were randomly divided into control group, model group, soybean extract prevention group and soybean extract treatment group. The atherosclerotic lesion rabbit model induced by hyperhomocysteinemia was used in all the groups except for the control group. Then, the rabbits of the prevention and the treatment groups were fed with soybean extracts with the following three doses: 30 mg/kg (low dose group), 60 mg/kg (middle dose group) and 180 mg/kg (high dose group) at week 0 and week 12, respectively. The experiment lasted for 24 weeks. The content of serum homocysteinemia was deteced by ELISA and atherosclerotic lesions were examined under light microscope. 【Results】The serum level of homocysteine in each experimental group was significantly increased and the pathological changes of aortic wall were apparent to different degrees compared with those in the control group after 12 weeks (P < 0.05). Additionally, soybean extracts significantly decreased the levels of the homocysteine in a dose-dependent manner compared with model group and inhibited the pathological changes of aortic wall induced by hyperhomocysteinemia (P< 0.05).【Conclusions】The aortic atherosclerotic lesionsbook=14,ebook=20can be induced by hyperhomocysteinemi in rabbit. Soybean extracts can reduce the serum homocysteine level and the formation of aortic atherosclerotic lesions.

Key words:homocysteine; atherosclerosis; lesion; soybean extract

*基金項(xiàng)目：貴州省科學(xué)技術(shù)基金[No：黔科合J字LKZ（2010）28]

收稿日期：2014-12-06

文章編號(hào)：1005-8982（2015）23-0013-05

中圖分類號(hào)：R543.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A