膀胱癌組織中肺癌腫瘤抑制物1基因啟動子甲基化狀態(tài)和蛋白表達及其臨床意義*

楊永姣 ，劉莉 ，陳業(yè)剛 ，王尚任 ，劉曉強 ，陳少峰 ，孫光

（1.天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院 泌尿外科，天津 300211；2.天津市泌尿外科研究所，天津 300211）

肺癌腫瘤抑制物1（tumor suppressor in lung cancer1，TSLC1），又稱細胞黏附分子 1（cell adhesion molecule1，CADM1），是 2001年由 KURAMOCHI等[1]在人類非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）中發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，定位于染色體11q23.2，翻譯生成442個氨基酸殘基的跨膜糖蛋白。大量研究顯示，TSLC1在一系列人類腫瘤組織和細胞系中呈低表達或缺失，包括食管癌[2]、黑色素瘤[3]、肝癌[4]、卵巢癌[5]、乳腺癌[6]、肺癌[7]、喉鱗癌[8]、結(jié)腸癌等[9]，其低表達與啟動子區(qū)CpG島甲基化相關(guān)[6，10]。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，膀胱尿路上皮癌組織中TSLC1蛋白表達降低，與病理分級呈負相關(guān)[11]。本研究采用甲基化特異性PCR（MSP）檢測84例膀胱尿路上皮癌組織和20例正常膀胱黏膜組織中TSLC1基因啟動子CpG島甲基化狀態(tài)，WB檢測TSLC1蛋白的表達，以探討TSLC1基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)和蛋白表達的關(guān)系及其意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年3月-2014年4月在天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院泌尿外科行手術(shù)治療的84例膀胱尿路上皮癌患者的癌組織，病理結(jié)果均為尿路上皮癌；同時收集同期住院的20例良性前列腺增生患者的正常膀胱黏膜組織，病理結(jié)果均為正常膀胱黏膜。84例膀胱尿路上皮癌患者中，男性58例，女性26例；年齡48～82歲，中位數(shù)年齡66歲，其中年齡≤65歲33例，＞65歲51例；單發(fā)腫瘤34例，多發(fā)腫瘤50例；腫瘤直徑≤3 cm 49例，＞3 cm 35例；復發(fā)性腫瘤49例，原發(fā)性腫瘤35例；病理分級低級別57例，高級別27例；腫瘤分期Ta、Tis及T150例，T2～T434例。所有標本均于術(shù)后0.5 h內(nèi)獲得，液氮速凍后置入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒、DNA修飾試劑盒購自O(shè)mega公司，甲基化轉(zhuǎn)移酶購自Solarbio公司，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，組織蛋白提取試劑盒購自博士德生物，鼠抗人TSLC1單克隆抗體購自Abnova公司，二抗羊抗鼠單克隆抗體、GAPDH內(nèi)參抗體及BCA蛋白濃度測定試劑盒購自康為世紀。

1.3 實驗方法

1.3.1 TSLC1基因啟動子CpG島甲基化檢測 采用E.Z.N.A.TMTissue DNA Kit試劑盒提取基因組DNA，每個樣本取30 mg左右的組織至加有200μl Buffer TL的離心管中，剪碎后勻漿處理，加入25μl OB蛋白酶，混勻，55℃水浴至組織完全消化，室溫10 000×g離心5 min去除雜質(zhì)，將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管，加入220μl Buffer BL渦旋混勻，70℃水浴10 min，加入220μl的無水乙醇，高速渦旋15 s混勻，轉(zhuǎn)移混合液至套有收集管的HiBind DNA柱子中，室溫下8 000×g離心1 min，棄去濾液，把柱子裝在新收集管中，加入 500μl HB Buffer，室溫8 000×g離心1 min，棄去濾液，把柱子裝在新收集管，加入 700μl DNA Wash Buffer，室溫 8 000×g離心1 min，棄去濾液，把柱子重新裝回收集管，12 000×g離心空柱2 min以甩干柱子基質(zhì)，把柱子裝在干凈的1.5 ml離心管上，加入200μl 70℃預(yù)熱的Elution Buffer到柱子基質(zhì)上，室溫下靜置3 min后室溫10 000×g離心1 min以洗脫DNA，保留含DNA的洗脫液。在UV3000紫外分光光度儀上測定吸光度值鑒定DNA純度，OD260/OD280比值在1.8～2.0。甲基化特異性PCR（MSP）：用修飾試劑盒EZ DNA Methylation-Gold KitTM取1μgDNA進行修飾，在PCR管中添加130μl CT Conversion Reagent到每20μl DNA樣品中（如果DNA樣品的體積＜20μl，則用水來彌補差量），98℃放置10 min，64℃放置2.5 h，添加 600μl M-Binding Buffer到 Zymo-Spin ICTM Column中，并將柱放入Collection Tube中，裝填樣品到含有M-Binding Buffer的Zymo-Spin ICTM Column 中，混勻，全速（≥10 000×g）離心 30 s，棄去濾液，添加200μl M-Wash Buffer到柱中，全速離心30 s，添加200μl M-Desulphonation Buffer到柱中并且室溫下放置20 min，全速離心30 s，添加200μl M-Wash Buffer到柱中，全速離心30 s，添加10μl的M-Elution Buffer到柱基質(zhì)中，將柱放置在1.5 ml的管中，全速離心來洗脫DNA。取修飾好的DNA 4μl進行MSP反應(yīng)。TSLC1基因甲基化引物M，正向引物：5'-TTTTAATTATTATTTTCGAGTTTATC G-3'，反向引物：5'-TCTTTAAAAACGAAAACTATAC G-3'；非甲基化引物U，正向引物：5'-TTTTTTAATTA TTTTTGAGTTTATTG-3'，反向引物：5'-AAATCTTTA AAAACAAAAACTATAC-3'。反應(yīng)體系參照PCR試劑盒推薦量50μl：PCR混合液25μl，上下游引物各2μl，模板 4μl，無核酶水 17μl。MSP 循環(huán)條件：95℃預(yù)變性 10 min，94℃變性 30 s，57℃（甲基化引物）或55℃（非甲基化引物）退火30 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸5 min。為保證檢測結(jié)果的可靠性，以經(jīng)甲基轉(zhuǎn)移酶（M SssI）和未經(jīng)M SssI處理的正常人外周血淋巴細胞DNA分別作陽性和陰性對照組。取PCR產(chǎn)物10μl行2%瓊脂糖凝膠電泳，110 V電泳40 min，凝膠成像系統(tǒng)下照相。結(jié)果判定標準：只要應(yīng)用甲基化引物擴增出特異性條帶即可認為存在甲基化（M），只有應(yīng)用非甲基化引物擴增出特異性條帶方可認為不存在甲基化（U）。

1.3.2 Western blot檢測膀胱癌組織和膀胱正常黏膜組織中TSLC1蛋白的表達水平 按照組織凈重（mg）∶裂解液（μl）=1∶10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液進行勻漿，冰上孵育2 h，直至充分裂解、離心后取少量上清液，根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書繪制標準曲線并檢測樣本蛋白濃度，制備SDS-PAGE凝膠，計算取出20μg蛋白經(jīng)沸水煮5min后上樣，設(shè)置電壓為80 V，電泳1.5 h；把電泳分離的樣品從凝膠轉(zhuǎn)移到固相載體PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗鼠抗人TSLC1單克隆抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜、二抗羊抗鼠單克隆抗體（1∶5 000）孵育2 h，以鼠抗人GAPDH作為內(nèi)參。ECL化學發(fā)光試劑加在PCDF膜上反應(yīng)5 min，凝膠成像分析系統(tǒng)下顯影、定影。利用Image-Pro Plus 5.0軟件對蛋白表達的灰度值進行分析，蛋白相對表達為目的基因與內(nèi)參基因的比值。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，膀胱癌患者組及其對照組中TSLC1基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)的比較用Fisher’s確切概率法，膀胱癌患者中TSLC1基因啟動子甲基化與臨床病理特征的關(guān)系用四格表χ2檢驗，膀胱癌組和正常組TSLC1蛋白表達的比較用兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TSLC1基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)及其與臨床病理特征的關(guān)系

圖1 膀胱癌組織中TSLC1基因啟動子甲基化狀態(tài)

附表 TSLC1基因啟動子甲基化與膀胱癌臨床病理特征的關(guān)系 例（%）

續(xù)附表

MSP結(jié)果顯示，20例正常膀胱黏膜組織中未檢測到TSLC1基因啟動子甲基化；84例膀胱尿路上皮癌組織中43例檢測到TSLC1啟動子區(qū)CpG島甲基化（見圖 1），甲基化率為 51.2%（43/84），表明膀胱尿路上皮癌組織中TSLC1基因啟動子甲基化率明顯高于正常膀胱黏膜組織，TSLC1基因啟動子甲基化與膀胱癌的發(fā)生有關(guān)。膀胱尿路上皮癌組織中TSLC1基因啟動子甲基化與患者的性別、年齡、腫瘤數(shù)目無關(guān)（P＞0.05），而與腫瘤是否復發(fā)、腫瘤直徑病理分級和臨床分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見附表。

2.2 TSLC1蛋白表達及TSLC1基因啟動子甲基化與蛋白表達的關(guān)系

圖2 膀胱癌組織中TSLC1蛋白的表達

Western blot檢測結(jié)果表明，84例膀胱尿路上皮癌組織中TSLC1蛋白的表達水平為（0.2613±0.1405），明顯低于20例膀胱正常黏膜組織[（0.695 7±0.092 4）（t=7.457，P＜0.01）]（見圖2）。43例發(fā)生TSLC1基因啟動子甲基化的膀胱癌組織TSLC1蛋白表達水平為（0.114 3±0.044 3），明顯低于41例未發(fā)生TSLC1基因啟動子甲基化[（0.3756±0.0439）]（t=11.763，P＜0.01）。

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展是一個多因素相互作用的復雜過程，既有內(nèi)在遺傳因素，又有外在環(huán)境因素。雖然近年來膀胱癌的診治取得一些進展，但仍未能十分有效地阻止疾病的進展和改善患者的預(yù)后，因此有必要對其發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)因素進行深入研究。DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，該修飾影響著DNA和其他分子的相互作用，并且通過細胞分裂和增殖遺傳，在胚胎的早期發(fā)育、干細胞的分化和特定的基因表達中起重要作用[12]。近年來，DNA甲基化研究成為腫瘤學研究的一個熱點。

TSLC1是一種在NSCLC中發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，TSLC1可通過抑制增殖和促進凋亡來抑制腫瘤的生長，并可介導同種或異種細胞間的相互黏附，在抑制上皮組織來源的惡性腫瘤中起重要作用[13]，TSLC1功能喪失可導致癌細胞浸潤及轉(zhuǎn)移[14]，一系列人類腫瘤組織和細胞系中TSLC1呈低表達或缺失，且其低表達與啟動子區(qū)CpG島甲基化相關(guān)[2-9，15-16]。TSLC1基因啟動子甲基化可以作為一種腫瘤診斷、檢測和預(yù)后判斷的分子標記物。同時有研究發(fā)現(xiàn)，去甲基化藥物天花粉蛋白處理宮頸癌HeLa細胞后可逆轉(zhuǎn)TSLC1基因甲基化狀態(tài)，從而誘導其重新表達發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖的作用[17]。本實驗應(yīng)用MSP同時檢測20例膀胱正常黏膜組織和84例膀胱尿路上皮癌組織中TSLC1基因啟動子甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)51.2%（43/84）的膀胱尿路上皮癌組織中存在TSLC1基因甲基化，而在20例正常膀胱黏膜組織中未檢測到TSLC1基因甲基化，提示TSLC1基因啟動子甲基化有腫瘤特異性，有望作為膀胱尿路上皮癌的診斷標記物。

本實驗將TSLC1基因啟動子甲基化狀態(tài)與患者的臨床資料進行分析后發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性腫瘤中TSLC1基因甲基化率為37.1%，復發(fā)性腫瘤中甲基化率為67.3%；直徑≤3 cm的腫瘤中甲基化率為42.9%，直徑＞3 cm的腫瘤中甲基化率為68.6%；低級別腫瘤中甲基化率為43.9%，高級別腫瘤中甲基化率為74.1%；非肌層浸潤性膀胱癌中甲基化率為44.0%，肌層浸潤性膀胱癌中甲基化率為76.5%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。該結(jié)果提示TSLC1基因啟動子甲基化與膀胱尿路上皮癌的大小、是否復發(fā)、分化程度和浸潤深度等腫瘤的生物學行為有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)在84例膀胱尿路上皮癌組織和20例膀胱正常黏膜組織中，膀胱癌組織中TSLC1蛋白的表達水平明顯低于正常組織；43例發(fā)生TSLC1基因啟動子甲基化的膀胱癌組織TSLC1蛋白表達水平明顯低于41例未發(fā)生TSLC1基因啟動子甲基化的膀胱癌組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），研究結(jié)果與前期研究發(fā)現(xiàn)膀胱尿路上皮癌組織中TSLC1蛋白表達降低相符[11]。結(jié)果提示TSLC1基因啟動子CpG島甲基化可能是導致其蛋白表達下調(diào)的主要原因之一。

本研究結(jié)果表明，在膀胱尿路上皮癌組織中，TSLC1基因具有較高的甲基化率，并且與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此有必要進一步研究TSLC1在膀胱癌中的功能及其可能機制，為膀胱癌早期診斷、判斷預(yù)后及基因治療提供新的理想靶點奠定研究基礎(chǔ)。

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