三七皂甙Rb1對大鼠慢性阻塞性肺疾病線粒體的防護(hù)作用

劉鵬年 李憶蘭 張路 謝飛 李劍瑜 武凡

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)以持續(xù)氣流受限為特征，是導(dǎo)致高致殘率和高致死率的呼吸系統(tǒng)的慢性疾病之一，目前尚無有效的治療方法。三七總皂甙是五加科人參屬植物三七的主要有效的活性成分，其中以三七皂甙Rg1、Rb1及三七皂甙R1含量最高，目前對三七皂甙Rg1研究較多，但對Rb1知道甚少，而且機(jī)制尚不明確［1］。對三七皂甙Rb1的研究主要是探討三七皂甙對自由基和細(xì)胞因子的影響，對其防護(hù)COPD線粒體的作用機(jī)理目前鮮見報導(dǎo)［2］。課題組用煙熏法復(fù)制大鼠COPD模型，從組織學(xué)、生物化學(xué)、生物物理學(xué)等方面多層次地研究三七皂甙單體Rb1對慢性阻塞性肺疾病大鼠線粒體的作用及作用機(jī)理，為開發(fā)三七單體Rb1在臨床防護(hù)COPD的應(yīng)用提供盡可能詳盡的試驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

三七皂甙Rb1購自昆明植物研究所;呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及ATP合酶試劑盒購自R＆D system公司;親脂性陽離子熒光染料Rhodamine123購于 sigma 公司;1，6-二苯基-1，3，5 乙三稀(1，6-diphenyl-1，3，5-hexatriene，DPH)購自瑞典 Fluka 公司;分泌型磷脂酶A2(secretory phospholipase A2，sPLA2)試劑盒購自assay kit，R＆D system公司，采用全自動酶免分析儀測定，sPLA2活性的測定嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量(200±10)g，動物購自河北醫(yī)科大學(xué)動物試驗(yàn)中心，合格證號:冀醫(yī)動字號04056。

1.3 動物模型復(fù)制

參照文獻(xiàn)［3］并加以改進(jìn)，將40只大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，Ⅰ組PBS灌胃作為對照組，Ⅱ組COPD模型制作:第1天和第14天向氣管內(nèi)滴入LPS各 1 g/L，2～13日和 15～42日在 80 cm×50 cm×40 cm密閉箱內(nèi)香煙熏蒸0.5小時(烤煙型，焦油量14 mg，煙氣煙堿量1.1 mg)，Ⅲ保護(hù)組在制模同時每日腹腔注射Rb1 10 mg/kg為Rb1組低劑量，Ⅳ保護(hù)組每日腹腔注射Rb1 20 mg/kg為Rb1組高劑量組，COPD模型組每日腹腔注射等劑量生理鹽水。制模后處死各組大鼠，提取肺臟線粒體作呼吸鏈復(fù)合體活性、ATP合酶活性、線粒體膜電位、線粒體熒光偏振度及sPLA2活性測定。

1.4 標(biāo)本采集

1.4.1 線粒體的提取 制模后處死大鼠，迅速取出新鮮大鼠肺臟，加入帶有冰渣的分離介質(zhì)中，電動勻漿器勻漿，制成10%的肺組織勻漿液，用低溫差速600 g離心10分鐘，取上清，再以12500 g離心10分鐘，留沉淀，此為肺臟組織線粒體。沉淀用分離介質(zhì)再次懸浮，以12500 g離心10分鐘，本次沉淀為提純的線粒體，沉淀加入分離介質(zhì)制成線粒體懸液，用以下面各指標(biāo)測定。

1.4.2 呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及ATP合酶的測定 用于測定呼吸鏈復(fù)合酶的線粒體懸液稀釋成2 mg/mL，分裝后－70℃保存，測定前反復(fù)凍融3次使之成為線粒體膜片段，呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及ATP合酶的測定，嚴(yán)格按照說明書用分光光度法測定，呼吸鏈的活性單位nmol/(min·mg)蛋白質(zhì)。ATP合酶的活性單位為μmolPi/(min·mg)。

1.4.3 線粒體膜電位和線粒體膜流動性的測定

參照文獻(xiàn)［4］提取線粒體，以陽離子熒光染料Rhodamine123所引起的遞質(zhì)中熒光值的變化反映線粒體膜電位。用熒光分光光度計測量，激發(fā)波長500 nm，發(fā)射波長525 nm，熒光基準(zhǔn)值為F1，再加入100 μL線粒體，5000 g離心10分鐘，取上清測定熒光值F2，以ΔF=(F1－F2)，線粒體蛋白量(mg)－1計算每mg線粒體蛋白引起的熒光變化。線粒體攝取Rhodamine123增加，則膜電位水平增加。Rhodamine123在活細(xì)胞內(nèi)主要與線粒體結(jié)合，線粒體受損時，攝取Rhodamine123的量偏低，膜電位下降。

線粒體膜流動性的測定:取肺臟組織，參照文獻(xiàn)［4］提取線粒體內(nèi)膜，采用熒光標(biāo)記與熒光偏振法，激發(fā)光波362 nm，發(fā)射光波長432 nm，在熒光分光光度計上(加偏振片)測定膜熒光偏振度(P)，按公式η=2p/0.46－P，求出平均微黏度。熒光偏振度越高，微黏度就越高，膜的流動性越低。

1.4.4 sPLA2活性的測定 采用全自動酶免分析儀測定，sPLA2活性的測定嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

表1 Rb1對COPD大鼠肺臟線粒體呼吸鏈復(fù)合物(Ⅰ～Ⅴ)活性的影響

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

各組數(shù)據(jù)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料用(±s)表示，并經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊時兩兩比較采用組間Q檢驗(yàn)，檢測各資料的統(tǒng)計學(xué)顯著性差異，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異非常顯著。

2 結(jié)果

2.1 Rb1對COPD大鼠肺臟線粒體呼吸鏈復(fù)合物(Ⅰ～Ⅴ)活性的影響

呼吸鏈(Ⅰ～Ⅳ)的活性單位nmol/(min·mg)蛋白質(zhì)。呼吸鏈Ⅴ即ATP合酶的活性單位為μmol Pi/mg。呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ稱為線粒體電子傳遞體。

本試驗(yàn)觀察到與對照組相比，COPD組大鼠肺臟線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ活性顯著下降(P＜0.01)，分別下降51.0%、55.3%和60.8%、57.3%。由表1可見，Rb1 10 mg/kg治療組和Rb1 20 mg/kg治療組與COPD組相比有顯著性差異(P＜0.01)。而對于復(fù)合物Ⅳ的活性，Rb1 10 mg/kg治療組與Rb1 20 mg/kg治療組相比，差異有顯著性(P＜0.05)。提示:COPD嚴(yán)重影響大鼠肺臟線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性，尤其是復(fù)合物Ⅳ即限速酶的活性;Rb1對大鼠肺臟線粒體膜的呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的活性有顯著保護(hù)作用。

2.2 Rb1對COPD大鼠肺臟線粒體膜電位和膜流動性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與對照組相比，COPD組大鼠攝取Rhodamine 123顯著降低，相對熒光強(qiáng)度低，線粒體膜電位顯著低于對照組(P＜0.01)，說明線粒體膜的結(jié)構(gòu)受損。COPD組線粒體膜的偏振度增加，膜的微黏度升高，導(dǎo)致線粒體膜的流動性下降。Rb1 10mg/kg組和Rb1 20mg/kg組與COPD組相比有明顯差異(P＜0.01)，提示Rb1對慢阻肺線粒體膜的保護(hù)作用。見表2。

表2 Rb1對COPD大鼠肺臟線粒體膜電位和膜流動性的影響

2.3 三七皂甙Rb1對COPD大鼠肺臟線粒體sPLA2活性的影響

與對照組相比，COPD組大鼠肺臟線粒體sPLA2于制模后迅速增高，P＜0.01;與COPD組相比，Rb1 10mg/kg組和Rb1 20mg/kg組sPLA2活性明顯低于相應(yīng)的COPD組，P＜0.01;與Rb1 10mg/kg組相比，Rb1 20mg/kg組sPLA2活性有顯著性差異，說明Rb1減低sPLA2活性的劑量依賴性。見表3。

表3 三七皂甙Rb1對COPD大鼠肺臟線粒體sPLA2活性的影響

3 討論

De-Luca等［4］認(rèn)為COPD患者肺實(shí)質(zhì)破壞的典型表現(xiàn)為小葉中央型的肺氣腫，由炎癥介質(zhì)引起的肺臟線粒體結(jié)構(gòu)與功能的改變及細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的紊亂被認(rèn)為是肺臟線粒體結(jié)構(gòu)破壞的主要機(jī)制。目前對COPD主要采用對癥治療，現(xiàn)有的治療方法令人堪憂。本實(shí)驗(yàn)詳細(xì)的研究COPD大鼠肺臟線粒體膜復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能的改變、細(xì)胞因子sPLA2的變化，探討三七皂甙Rb1對COPD大鼠肺臟線粒體的防護(hù)作用及作用機(jī)理。

線粒體呼吸鏈的電子傳遞是由5個酶復(fù)合體構(gòu)成的，呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ～Ⅳ稱為線粒體電子傳遞體，進(jìn)行電子傳遞和將質(zhì)子跨膜到線粒體內(nèi)膜外的功能。呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ是線粒體電子傳遞鏈的末端轉(zhuǎn)移酶，是氧化磷酸化的限速酶［5］。當(dāng)質(zhì)子順此梯度經(jīng)復(fù)合體Ⅴ(ATP合酶)F0部分回流時，其F1部分催化ADP和Pi生成ATP，因此ATP合酶能直接反應(yīng)線粒體的呼吸功能［6］。本實(shí)驗(yàn)支持 Makabe［5］的觀點(diǎn)，觀察到COPD大鼠線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ活性顯著下降，表明COPD不僅對以NADH為底物的呼吸鏈起始端有影響，且對呼吸鏈的限速酶復(fù)合物Ⅳ影響尤為顯著(P＜0.01)。由于線粒體電子傳遞體功能下降，不能建立起有效的質(zhì)子跨膜梯度，因此ATP生成減少;同時本實(shí)驗(yàn)觀察到能直接反應(yīng)線粒體呼吸功能的ATP合酶活性下降，進(jìn)一步ATP生成減少，加重線粒體的損害。三七皂甙Rb1組與COPD組相比，三七皂甙Rb1明顯增高呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ復(fù)合物的活性、總ATPase活性，P＜0.01。本實(shí)驗(yàn)表明三七皂甙Rb1對COPD大鼠線粒體呼吸鏈復(fù)合體有顯著的保護(hù)作用，有利于線粒體結(jié)構(gòu)與功能的恢復(fù)。

Makabe［5］報道線粒體呼吸鏈復(fù)合物的損傷可促進(jìn)線粒體膜通透性增高，離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能紊亂，影響線粒體膜電位的正常維持。本實(shí)驗(yàn)觀察到COPD大鼠肺臟線粒體膜電位顯著下降，與對照組相比P＜0.01，三七皂甙Rb1明顯增高線粒體膜電位，提高線粒體的功能。

正常的線粒體膜流動性為膜發(fā)揮各種生理功能，呼吸鏈上電子傳遞過程和氧化磷酸化過程均依賴與呼吸鏈活性成分在內(nèi)膜中的側(cè)向擴(kuò)散和碰撞，即膜的流動性［7］。本實(shí)驗(yàn)采用熒光偏振法。實(shí)驗(yàn)檢測到COPD大鼠線粒體膜流動性明顯下降，其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01，提示大鼠線粒體呼吸鏈復(fù)合物的損傷，導(dǎo)致線粒體膜剛性增加，流動性下降，與李憶蘭等［8］研究的急性COPD大鼠線粒體膜偏振度相比，沒有明顯差異，說明急性和慢性COPD大鼠線粒體膜的流動性均下降明顯。與COPD組大鼠線粒體相比，三七皂甙Rb1 10 mg/kg組和Rb1 20 mg/kg組減低熒光偏振度，降低微黏度，導(dǎo)致膜流動性顯著增加，P＜0.01，保護(hù)了線粒體膜，使其發(fā)揮正常的功能。

DeLuca等［9］提出sPLA2參與肺組織炎癥的產(chǎn)生和肺泡表面活性物質(zhì)的代謝，在急慢性肺損傷中起著重要作用，有可能成為肺損傷治療的靶點(diǎn)。目前有學(xué)者報道［10］在正常情況下，磷脂酰絲氨酸位于磷脂雙分子層的內(nèi)側(cè)不易被sPLA2水解。當(dāng)肺臟線粒體受損時，線粒體膜分子重排，磷脂酰絲氨酸暴露在胞膜外側(cè)，而sPLA2水解的最適底物為磷脂酰絲氨酸，因此sPLA2迅速水解磷脂酰絲氨酸產(chǎn)生并釋放脂類介質(zhì)，加重了COPD線粒體的損害，而線粒體損害使sPLA2活性進(jìn)一步增高，sPLA2在這個級聯(lián)反應(yīng)中處于關(guān)鍵位置。三七皂甙Rb1明顯降低sPLA2活性并對其有明顯劑量依賴性，因而降低COPD線粒體損傷的產(chǎn)生與擴(kuò)散。

總之COPD的形成是一個綜合的多因素參與的過程，sPLA2對線粒體膜磷脂酰絲氨酸的水解造成線粒體膜的結(jié)構(gòu)與功能的改變。三七皂甙Rb1通過降低sPLA2活性和脂類介質(zhì)對COPD線粒體的損害，維持了肺臟線粒體正常膜電位，恢復(fù)膜的流動性，使呼吸鏈復(fù)合物活性恢復(fù)，改善了線粒體能量代謝，對COPD大鼠肺臟線粒體有顯著的保護(hù)作用，從而起到防治COPD的作用。

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