石榴種皮木質(zhì)素合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因PgMYB的克隆與表達

曹丹琴,楊　健,關(guān)曉彎,張永娟,龔凌燕,張水明

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,合肥 230036)

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石榴種皮木質(zhì)素合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因PgMYB的克隆與表達

曹丹琴,楊健,關(guān)曉彎,張永娟,龔凌燕,張水明*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,合肥 230036)

摘要:為初步探討石榴(PunicagranatumL.)籽粒硬度產(chǎn)生機理及轉(zhuǎn)錄因子基因PgMYB在石榴種皮木質(zhì)素生物合成途徑中的作用,測定了不同石榴品種籽粒硬度及種皮總木質(zhì)素含量并分析兩者關(guān)系,利用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù),克隆了‘紅玉石籽’石榴的1個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因(PgMYB),通過實時熒光定量PCR技術(shù)分析了PgMYB的相對表達量。結(jié)果表明:(1)石榴籽粒硬度與種皮總木質(zhì)素含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.906。(2)PgMYB基因cDNA全長1 088 bp,開放閱讀框921 bp,編碼蛋白由306個氨基酸組成,N端具有2個MYB DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,是植物中一個典型的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子;同源分析顯示,該基因編碼的氨基酸序列與銀合歡的MYB1和擬南芥的MYB4一致性分別高達89%和84%。(3)在不同籽粒硬度石榴品種中PgMYB的表達與籽粒硬度和種皮總木質(zhì)素含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。(4)在石榴各個發(fā)育時期中,PgMYB表達與種皮總木質(zhì)素含量同樣呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。推測該基因可能抑制石榴種皮總木質(zhì)素的生物合成。

關(guān)鍵詞:石榴;籽粒硬度;種皮;總木質(zhì)素;PgMYB基因;表達分析

石榴(PunicagranatumL.)為石榴科石榴屬多年生落葉果樹,主要分布在陜西、安徽、山東、四川、新疆、云南等地[1]。石榴果實中含有豐富的天然活性物質(zhì),具有較高的保健價值[2]。石榴中的軟籽品種核軟可食,無需吐籽,因而更受消費者喜愛,但有關(guān)軟籽性狀形成機理的研究甚少。山東農(nóng)業(yè)大學(xué)在棗莊的調(diào)查發(fā)現(xiàn)石榴樹隨著更新次數(shù)的增加,果實種子有退化變軟現(xiàn)象[3]。陸麗娟等[4]研究中國代表性石榴品種硬度時指出石榴種子硬度性狀可能受多基因控制,且可能存在主效基因,同時發(fā)現(xiàn)光照、樹體營養(yǎng)等環(huán)境因素對種子硬度也具有一定影響。

石榴籽粒包含假種皮、種皮和種仁等3個部分,通?？墒秤貌糠譃榧俜N皮,種仁中富含多種脂肪酸和蛋白質(zhì),具有較高的營養(yǎng)價值[5],而種皮中木質(zhì)素含量較高[6]。木質(zhì)素是植物體內(nèi)的一種芳香性高聚物,主要沉積在維管植物次生增厚的細胞壁中[7]。木質(zhì)素的生物合成主要受兩類基因控制,一類是結(jié)構(gòu)基因,另一類是調(diào)節(jié)基因。研究發(fā)現(xiàn),MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物苯丙烷類次生代謝途徑的調(diào)節(jié),該過程與木質(zhì)素的合成調(diào)控密切相關(guān)[8-9]。根據(jù)高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域R的數(shù)目,可以把MYB轉(zhuǎn)錄因子分為單一MYB結(jié)構(gòu)域蛋白(R3-MYB)、2個重復(fù)MYB結(jié)構(gòu)域蛋白(R2R3-MYB)和3個重復(fù)MYB結(jié)構(gòu)域蛋白(R1R2R3-MYB)[10]。其中R2R3-MYB可能是最直接調(diào)控木質(zhì)素生物合成與沉積的轉(zhuǎn)錄因子,它們能調(diào)控參與苯丙烷類物質(zhì)合成相關(guān)基因的表達,從而影響木質(zhì)素的含量[11]。如火炬松(Pinustaeda)的PtMYB1、PtMYB4和PtMYB8[12-13],擬南芥的AtMYB58、AtMYB63[14]促進木質(zhì)素的生物合成。玉米(Zeamays)的ZmMYB31和ZmMYB42[15],擬南芥的AtMYB4[16],雜交楊(PopulustremulaL.×tremuloidesMichx.)的PttMYB21a[17],銀合歡(Leucaenaleucocephala)的LlMYB1[18],金魚草(AntirrhinummajusL.)的AmMYB308和AmMYB330[19]則抑制木質(zhì)素的生物合成。在石榴中尚未見到關(guān)于木質(zhì)素生物合成相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究報道。

本研究通過測定不同石榴品種的籽粒硬度與種皮總木質(zhì)素含量,分析兩者相關(guān)性,同時從參與木質(zhì)素合成代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控手段入手,應(yīng)用RACE技術(shù)克隆PgMYB基因cDNA全長,Real time-PCR技術(shù)分析PgMYB在石榴不同品種和不同發(fā)育時期種皮中的表達特性,為深入研究石榴軟籽性狀形成機理打下了基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1試驗材料

材料采自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)園石榴資源圃,土肥水管理水平一致。于2013年9月15日分別采集5年樹齡的‘突尼斯軟籽’、‘會理軟籽’和‘紅玉石籽’3個不同硬度品種成熟度一致的果實若干,剝?nèi)∈褡蚜?部分4 ℃保存,用于籽粒硬度和總木質(zhì)素含量測定;部分-80 ℃保存,用于基因克隆與表達。

2013年5月20日始,在花后20、40、60、80、100和120 d,分別從‘紅玉石籽’樹冠外圍東、西、南、北面及內(nèi)膛枝條上摘取同期坐果、大小一致果實各2個,剝?nèi)∈褡蚜?部分4 ℃保存,用于總木質(zhì)素含量測定;部分-80 ℃保存,用于基因表達分析。

1.2不同品種石榴籽粒硬度測定

隨機選取‘突尼斯軟籽’、‘會理軟籽’和‘紅玉石籽’3個品種的石榴籽粒各20個,去除外層假種皮,擦凈待用。選用Texture Analyser質(zhì)構(gòu)儀P/36R圓柱型平底探頭,在質(zhì)構(gòu)剖面分析(Texture Profile Analysis,TPA)測試模式下,設(shè)定0.5 mm的目標(biāo)壓縮形變量(進入樣品的運行距離),探頭對樣品進行兩次壓縮循環(huán),測得所需的硬度質(zhì)構(gòu)指標(biāo),單位為g·cm-2。

1.3總木質(zhì)素含量測定

采用巰基乙酸法[20]分別對‘突尼斯軟籽’、‘會理軟籽’、‘紅玉石籽’3個石榴品種和花后20、40、60、80、100和120 d的‘紅玉石籽’石榴種皮的總木質(zhì)素含量進行測定,各樣品測定均3次重復(fù)取平均值。

1.4PgMYB基因cDNA全長克隆及生物信息學(xué)分析

1.4.1石榴MYB基因中間片段的獲得根據(jù)GenBank上已經(jīng)登錄的幾種植物MYB基因的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域保守區(qū)設(shè)計目的片段擴增引物MYB-F和MYB-R(表1),參照改良的CTAB法[21]提純‘紅玉石籽’石榴種皮的總RNA,以其為模板進行RT-PCR,PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環(huán);72 ℃ 延伸10 min,PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物進行回收并連接至pGEM-Teasy載體(Promega公司)上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(上?？禎櫳锕?進行克隆,挑取單菌落進行菌液PCR檢測,將陽性菌落送至上海生工生物公司進行測序。

1.4.2cDNA末端擴增根據(jù)獲得的MYB中間片段核苷酸序列,設(shè)計用于3′端和5′端克隆的基因特異引物(表1)。以3′-CDS為接頭(表1),反轉(zhuǎn)錄得到3′-RACE cDNA,分別用3′GSP1、3′GSP2和3′通用引物UPM-Long和NUP進行3′端擴增,具體操作流程參照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit User Manual試劑盒(Clontech公司)說明書進行。用5′MYB-F1和5′MYB-R1進行5′端序列克隆,回收擴增產(chǎn)物并連接至pGEM-Teasy載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,篩選陽性克隆測序鑒定。

1.4.3PgMYB全長cDNA拼接及生物信息學(xué)分析將獲得的MYB中間片段和cDNA末端序列進行拼接,獲得PgMYB基因的cDNA全長序列。將PgMYB序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中用BLAST工具進行同源分析;利用ORF(Open Reading Frame,ORF)finder軟件尋找開放閱讀框;Protparam軟件(http://web.expasy.org/protparam/)分析編碼蛋白的氨基酸序列組成、分子量、等電點等理化性質(zhì);Psort(http://psort.hgc.jp/form.html)進行亞細胞定位分析;BioXM 2.6軟件進行蛋白質(zhì)一致性和相似性分析;用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.5PgMYB表達分析

1.5.1PgMYB在不同品種石榴種皮的表達分析運用RT-PCR檢測PgMYB基因在‘突尼斯軟籽’、‘會理軟籽’和‘紅玉石籽’3個品種石榴種皮中的表達情況,以石榴Actin為內(nèi)參,設(shè)計特異引物PgActin-F/PgActin-R及PgMYB-F/PgMYB-R(表1),在Step One PlusTM熒光定量PCR儀上進行擴增。采用20 μL反應(yīng)體系:SYBRTMPremixExTaq10 μL,10 μmol·L-1的上下游引物各0.8 μL,ROX Reference Dye 50X 0.4 μL,cDNA模板2.0 μL,ddH2O 6.0 μL。反應(yīng)程序為:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸 1 min,共40個循環(huán)。每個樣品4次重復(fù)。反應(yīng)完成后,用2-△△Ct法進行相對表達量分析。

1.5.2PgMYB在不同發(fā)育時期石榴種皮的表達分析以花后20、40、60、80、100和120 d的‘紅玉石籽’種皮cDNA為模板,以石榴Actin為內(nèi)參,對PgMYB基因表達量進行熒光定量檢測,具體方法同1.5.1。

2結(jié)果與分析

2.1石榴不同品種籽粒硬度和種皮總木質(zhì)素含量

3個石榴品種中,‘突尼斯軟籽’籽粒硬度最小,種皮總木質(zhì)素含量最低,分別為1 997 g·cm-2和6.36%;其次是‘會理軟籽’,籽粒硬度為3 811 g·cm-2,種皮總木質(zhì)素含量為7.57%;籽粒硬度和種皮總木質(zhì)素含量均最大的為‘紅玉石籽’,分別為4 235 g·cm-2和9.25%(圖1)。SPSS分析發(fā)現(xiàn),石榴籽粒硬度與種皮總木質(zhì)素含量呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.906。

表1　PCR擴增所用引物及其序列

2.2石榴PgMYB基因的克隆

RT-PCR擴增MYB基因cDNA同源片段,挑選陽性克隆測序得到一個長291 bp的核酸片段(圖2,A),序列比對結(jié)果顯示,該片段序列與水稻(Oryzasativa)的OsMYB2和玉米的ZmMYB31序列一致性分別高達87%和86%,初步判斷該片段為石榴MYB基因序列片段。

3′端擴增得到一個819 bp的帶有多聚A尾巴的片段(圖2,B),登陸NCBI進行核酸序列比對,表明該片段序列與玉米的ZmMYB31和柳枝稷(Panicumvirgatum)的PvMYB4a序列一致性高達85%,且3′端序列與原同源片段部分重疊,確認(rèn)其為石榴MYB基因的3′端序列。5′端擴增得到一個長436 bp的片段(圖2,C),序列比對分析確定為石榴MYB基因的5′端序列。

2.3PgMYB全長cDNA拼接及生物信息學(xué)分析

將獲得的兩端序列與同源片段序列進行拼接得到一個長1 088 bp的cDNA序列。序列分析表明,PgMYB基因編碼區(qū)由921個核苷酸組成,編碼一個含有306個氨基酸的蛋白質(zhì),起始密碼子為ATG,終止密碼子為TGA(圖3)。NCBI在線比對發(fā)現(xiàn),該基因編碼的氨基酸序列與銀合歡、楊樹(Populus)、擬南芥等植物中MYB轉(zhuǎn)錄因子基因編碼的氨基酸序列一致性都達到84%以上。Protparam分析其理化性質(zhì),推測該蛋白的分子式C1468H2332N454O461S17,相對分子量為34 262.4,等電點(pI)為8.85。InterPro數(shù)據(jù)庫鑒定結(jié)果顯示,Pg-MYB具有兩個典型的MYB-DNA-binding結(jié)構(gòu)域(圖4),為典型的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子基因。亞細胞定位研究表明,PgMYB蛋白定位于細胞核(可能性91.3%),符合轉(zhuǎn)錄因子的亞細胞定位特征。將PgMYB推導(dǎo)的氨基酸序列與其他植物中調(diào)控木質(zhì)素合成代謝的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列進行比對,并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖5),發(fā)現(xiàn)PgMYB與桉樹(Eucalyptusgunnii)的EgMYB1(GenBank登錄號:AJ576024.1)和擬南芥AtMYB32(GenBank登錄號:NM_119665.2)進化關(guān)系相對較近。GenBank中做同源性分析表明PgMYB基因氨基酸序列與其他MYB轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的同源區(qū)域主要集中在N端R2R3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,在C端同源性極低。

2.4不同品種石榴種皮PgMYB的表達和總木質(zhì)素含量分析

在籽粒硬度最小的‘突尼斯軟籽’中PgMYB相對表達量最大,以‘突尼斯軟籽’為1,‘會理軟籽’中PgMYB表達量為‘突尼斯軟籽’的0.38,籽粒硬度最大的‘紅玉石籽’中PgMYB表達量最低,僅為‘突尼斯軟籽’的0.23。籽粒硬度越小的品種,Pg-MYB表達量越高,同時種皮總木質(zhì)素含量就越低,相關(guān)分析結(jié)果顯示,PgMYB的表達與籽粒硬度和種皮總木質(zhì)素含量呈負(fù)相關(guān)(圖6)。

圖1　石榴不同品種籽粒硬度和種皮總木質(zhì)素含量

圖3　PgMYB基因的核苷酸序列和推測的氨基酸序列

圖2　PgMYB基因同源片段(A)、3′-RACE(B)和5′-RACE(C)擴增結(jié)果

圖4　不同植物MYB氨基酸序列比對

圖5　木質(zhì)素合成相關(guān)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子進化樹

2.5不同發(fā)育時期石榴種皮PgMYB的表達和總木質(zhì)素含量分析

RT-PCR分析PgMYB在‘紅玉石籽’不同發(fā)育時期種皮中的表達特性(圖7)發(fā)現(xiàn):在花后20 d,PgMYB表達量最高,且隨著果實發(fā)育,PgMYB的表達量逐漸下降。巰基乙酸法測定‘紅玉石籽’不同發(fā)育時期種皮的總木質(zhì)素含量(圖7),結(jié)果顯示:盛花后20、40、60、80、100和120 d,木質(zhì)素含量持續(xù)上升,在果實發(fā)育前期,木質(zhì)素含量積累較快,后期木質(zhì)素含量上升趨勢平緩。PgMYB表達與總木質(zhì)素含量呈負(fù)相關(guān)。

圖6　不同品種石榴種皮PgMYB的

圖7　不同發(fā)育時期石榴種皮PgMYB的

3討論

石榴果實營養(yǎng)豐富,其籽粒中含有豐富的維生素、煙酸、植物雌激素以及抗氧化物質(zhì)鞣酸等,具有多種醫(yī)療保健作用[22]。石榴籽粒有軟籽和硬籽之分,市場上較多的是鮮食硬籽品種,營養(yǎng)可利用價值少,而軟籽石榴核軟可食,營養(yǎng)充分利用,探討石榴軟籽性狀形成機理具有重要意義。本研究通過測定‘突尼斯軟籽’、‘會理軟籽’和‘紅玉石籽’的籽粒硬度和種皮總木質(zhì)素含量并分析兩者關(guān)系,發(fā)現(xiàn)石榴籽粒硬度與種皮中總木質(zhì)素含量呈顯著正相關(guān),種皮中的總木質(zhì)素是構(gòu)成籽粒硬度的一個重要組分,這為深入了解石榴軟籽性狀形成原因提供基礎(chǔ)。

木質(zhì)素生物合成主要受結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因兩類基因控制,由調(diào)節(jié)基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控結(jié)構(gòu)基因的表達。MYB是植物中最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一,在不同物種中,MYB蛋白結(jié)構(gòu)和序列存在差異,甚至同一物種的MYB家族也存在多個分支[23],MYB高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域為分離和鑒別MYB家族成員提供了理論基礎(chǔ)[24]。本研究根據(jù)與木質(zhì)素合成相關(guān)的MYB基因保守區(qū)域序列設(shè)計簡并引物,結(jié)合RACE技術(shù)從石榴中分離得到PgMYB基因,其推導(dǎo)的氨基酸N端具有2個保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,亞細胞定位顯示其定位于細胞核,符合轉(zhuǎn)錄因子亞細胞定位的特征。分析PgMYB蛋白與其他MYB蛋白的進化關(guān)系發(fā)現(xiàn)其與桉樹的EgMYB1[25]和擬南芥的AtMYB32[26]進化關(guān)系相對較近,而這兩者被鑒定為在木質(zhì)素生物合成中起轉(zhuǎn)錄抑制作用,推測PgMYB是一個R2R3亞類轉(zhuǎn)錄因子基因,可能在石榴種皮木質(zhì)素生物合成過程中起抑制作用。

本研究通過熒光定量PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)PgMYB在3個不同硬度石榴品種中的表達存在差異,籽粒硬度越小的品種,表達量越高,同時種皮總木質(zhì)素含量越低。對花后20、40、60、80、100和120 d的‘紅玉石籽’石榴種皮總木質(zhì)素含量進行測定,發(fā)現(xiàn)在其不同發(fā)育時期中,木質(zhì)素含量持續(xù)上升,而PgMYB的表達水平隨著發(fā)育期的進行逐漸下降,與總木質(zhì)素含量呈負(fù)相關(guān),推測PgMYB可能抑制石榴種皮木質(zhì)素的生物合成,這為深入了解和調(diào)控石榴軟籽性狀奠定了基礎(chǔ)。木質(zhì)素是影響石榴籽粒硬度的一個重要因子,由于木質(zhì)素生物合成途徑復(fù)雜,MYB蛋白作為植物中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子,其調(diào)控石榴種皮木質(zhì)素的生物合成途徑及其具體的作用機理還有待于進一步研究探討。

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(編輯:宋亞珍)

Clone and Expression of a Lignin Biosynthesis-related Transcription

Factor GenePgMYBin Pomegranate Seed Coat

CAO Danqin,YANG Jian,GUAN Xiaowan,ZHANG Yongjuan,GONG Lingyan,ZHANG Shuiming*

(College of Horticulture,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China)

Abstract:To study the mechanism of pomegranate seed hardness,and the function of transcription factor genePgMYBin lignin biosynthesis pathway of pomegranate seed coat,we measured the seed hardness and total lignin content in different pomegranate cultivars.A novelMYBtranscription factor genePgMYBwas isolated from cultivar ‘Hongyushizi’ by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and rapid amplification of cDNA ends (RACE).The expression levels ofPgMYBwere analyzed by real time-PCR.The results showed that:(1)The hardness of pomegranate seed and the total lignin content in seed coat were positively correlated with a correlation coefficient of 0.906.(2)The full-length cDNA ofPgMYBwas 1 088 bp with an open reading frame of 921 bp encoding a protein of 306 amino acid residues.It’s a typical R2R3-MYB transcription factor gene in plant with twoMYBDNA binding domains at its N-terminus.Blast X analysis showed thatPgMYBhad high identity withLeucaenaleucocephalaMYB1 andArabidopsisthalianaMYB4 as 89% and 84%,respectively.(3)Real time-PCR analysis indicated that the relative expression ofPgMYBwas negatively correlated with the hardness of pomegranate seed and total lignin content in seed coat.(4)At each stage of ‘Hongyushizi’ fruit development,the relative expression ofPgMYBwas always negatively correlated with the total lignin content in seed coat.It was speculated thatPgMYBmight repress the biosynthesis of lignin in pomegranate seed coat.The results expected to lay a foundation for study the mechanism of pomegranate seed hardness.

Key words:pomegranate;seed hardness;seed coat;lignin;PgMYBgene;expression analysis

中圖分類號:Q785;Q786

文獻標(biāo)志碼:A

作者簡介:曹丹琴(1990-),女,在讀碩士研究生,主要研究果樹種質(zhì)資源與生物技術(shù)育種。E-mail:15956998735@163.com*通信作者:張水明,博士,副教授,主要從事園藝植物種質(zhì)資源與生物技術(shù)育種研究。E-mail:zhangshm893@sohu.com

基金項目:國家自然科學(xué)基金(30900971)

收稿日期:2014-09-17;修改稿收到日期:2014-12-02

文章編號:1000-4025(2015)01-0023-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2015.01.0023